陳 沖，鄔 嬌，岳子婷，王 瑾，潘 檀，羅 軍，李 聰

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西省遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100）

山羊奶因具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的營養(yǎng)功能而越來越受到人們的關(guān)注與喜愛。首先，羊奶可以增強(qiáng)新生兒的免疫功能并在其生長發(fā)育過程中起重要作用，主要是羊奶中含有豐富的乳鐵蛋白、免疫球蛋白等小分子活性蛋白質(zhì)[1]。其次，山羊奶中的酪蛋白含有人體及畜體需要的絕大多數(shù)必需氨基酸，且氨基酸含量充足、種類齊全，并且蛋白質(zhì)消化率可達(dá)98%，更有利于人體的消化吸收[2]。山羊奶在人類健康方面的生理意義越來越被重視，研究羊乳中乳蛋白的合成調(diào)控機(jī)制對(duì)其營養(yǎng)價(jià)值的充分發(fā)揮具有重要意義。

溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（Solute Carrier，SLC）成員來源廣泛，主要由65 個(gè)家族組成，其功能多樣，可編碼大約400 種功能蛋白質(zhì)基因[3-4]，同一家族成員間具有約25% 的序列同源性[5]；溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)、吸收藥物和其他外源物質(zhì)的生理過程中具有重要作用。實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)泌乳高峰期具有高低乳蛋白含量的6 只奶山羊乳腺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)SLC7A5基因表達(dá)差異顯著，可作為調(diào)控奶山羊乳蛋白合成的關(guān)鍵候選基因（未發(fā)表）。SLC7A5（LAT-1）屬于APC（氨基酸多胺有機(jī)陽離子）超家族的SLC7 家族，由15 個(gè)成員組成，其中2 個(gè)是假基因，另外13 個(gè)編碼蛋白分為陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和異二聚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（LATs）2 個(gè)亞組[6-7]。SLC7A5（LAT-1）是一種非依賴于Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要和LAT2（SLC7A8）將亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、組氨酸和色氨酸運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中[8]，還可通過與糖蛋白SLC3A2二硫鍵相結(jié)合形成復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)亮氨酸等必需氨基酸。這些必需氨基酸不僅在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用，而且還參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑[9]。人類SLC7A5基因位于16 號(hào)染色體上，由507 個(gè)氨基酸構(gòu)成，具有12 次跨膜蛋白，分子質(zhì)量為55 ku，長達(dá)39 477 nt，含11 個(gè)外顯子[10]。而山羊SLC7A5基因位于18 號(hào)染色體上，編碼505 個(gè)氨基酸，含10 個(gè)外顯子。

本研究以西農(nóng)薩能奶山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，利用PCR技術(shù)克隆薩能奶山羊SLC7A5基因CDS 序列，并使用多款生物軟件和在線工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)分析其組織表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究SLC7A5基因在奶山羊乳蛋白質(zhì)合成方面的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 材料準(zhǔn)備：在西北農(nóng)林科技大學(xué)薩能羊原種場選擇健康并處于泌乳高峰期的西農(nóng)薩能奶山羊母羊3 只，屠宰后手術(shù)采集肝、脾、乳腺、腎、瘤胃、小腸等組織1～2 g，放置于焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的H2O 中漂洗，除去外層薄膜及殘余血跡后，迅速投入液氮保存，以用于組織總RNA 提取。試劑準(zhǔn)備：Primer Star MAX 聚合酶、pMD19-T 載體、DNA marker、RNA 提取試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；2K plus II、大腸桿菌（E.coli）。

1.2SLC7A5基因CDS 區(qū)克隆根據(jù)NCBI 中山羊SLC7A5基因序列（登錄號(hào)：XM_005691915.3），采用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)引物。上游引物（5'→3'）：GCCACCATGGCGGGCTCAGGCCCCA；下游引物（5'→3'）：TTACGTCTCCTGGGGAACCACGTG。提取山羊乳腺上皮細(xì)胞總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板（50 μmol/L）0.2 μL，Primer Star MAX酶10 μL，加滅菌水補(bǔ)充至20 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，98℃變性10 s，60℃退火5 s，延伸10 s。PCR 產(chǎn)物保存于4℃。采用1%瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測，切膠回收正確條帶。16℃連接PMD-19T 載體12 h。連接體系：膠回收產(chǎn)物（DNA片段）7 μL，Solution I 5 μL，PMD-19T 載體0.5 μL。經(jīng)過轉(zhuǎn)化（整個(gè)操作過程在冰上進(jìn)行），抽提質(zhì)粒，電泳后選擇陽性克隆質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3SLC7A5基因的生物信息學(xué)分析 經(jīng)NCBI 中的ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）鑒定開放閱讀框；采用ProtParam（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）在線分析SLC7A5基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)和特征；NetPhos（http://www.dabi.temple.edu/disphos/）預(yù)測蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)；采用TMHMM 軟件預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)；SignalP 4.1 Server 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析；TargetP 1.1 Server軟件預(yù)測蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位；以NPS（https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）預(yù)測蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，經(jīng)Phyre2（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk./psipred/）程序分析預(yù)測蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；將SLC7A5基因的DNA 序列和氨基酸序列在NCBI 上進(jìn)行Blast 同源比對(duì)，采用MEGA7.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用STRING（http://www.string-db.org/）交互式數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析。

1.4SLC7A5基因組織表達(dá)譜分析 分別提取3 只薩能奶山羊肝、脾、乳腺、腎、瘤胃、小腸6 個(gè)組織的總RNA，以及處于不同泌乳時(shí)期乳腺組織的總RNA。在TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明下，將RNA 反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。反轉(zhuǎn)錄采用兩步法進(jìn)行，操作過程要在冰上進(jìn)行。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 作為模板，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測其相對(duì)表達(dá)量，每只個(gè)體重復(fù)2 次，每次3 個(gè)重復(fù)。內(nèi)參基因?yàn)閁XT和MRPS9，定量引物SLC7A5（片段全長286 bp）為F：CTCACTGCCGTG AACTGCTA；R：CCAGGGGCAGGTTTCTGTAG；進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系15 μL：SYBR?Premix EX TaqTM（2×）7.5 μL，模板cDNA（1 000 μg/μL）1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.7 μL，ddH2O 5.1 μL。SLC7A5基因的組織相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。采用GraphPad Prism v7.0.4 進(jìn)行繪圖。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用軟件SPSS 17.0 進(jìn)行One-Way ANOVA顯著性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。當(dāng)P＜0.05 時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著；當(dāng)P＜0.01 時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1SLC7A5基因CDS 區(qū)克隆及測序 克隆后經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠檢測，擴(kuò)增條帶如圖1 所示，全長約為1 518 bp，經(jīng)與NCBI 上傳序列比對(duì)，可以確定為山羊CDS 區(qū)序列。堿基含量分別為：A=15.8%，T=21.2%，C=34.1%，G=28.9%。

圖1 SLC7A5 基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2SLC7A5基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 SLC7A5 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 西農(nóng)薩能奶山羊SLC7A5 蛋白質(zhì)含有氨基酸505 個(gè)；氨基酸分子量55.01 ku；理論等電點(diǎn)為8.18；總分子式為C2573H4022N616O670S22。分析得到不穩(wěn)定系數(shù)為37.74，為穩(wěn)定蛋白。其中亮氨酸（Leu）、纈氨酸（Val）和丙氨酸（Ala）含量占比相對(duì)較高，分別占14.1%、9.7%、9.5%。組氨酸（His）和天冬氨酸（Asp）含量占比相對(duì)較低，分別占1.0%和1.6%。帶負(fù)電殘基總數(shù)天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）為31 個(gè)，帶正電殘基總數(shù)精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）為34 個(gè)。推測SLC7A5 為堿性蛋白質(zhì)。

2.2.2 氨基酸序列及磷酸位點(diǎn)分析 通過DISPHOS1.3分析西農(nóng)薩能奶山羊SLC7A5 蛋白的氨基酸組成，結(jié)果見圖2。該蛋白共含有2 個(gè)絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)，1 個(gè)蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)，并在115 位有1 個(gè)酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)。

圖2 SLC7A5 基因磷酸化位點(diǎn)圖

2.2.3 SLC7A5 蛋白的亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域分析 SignalP 4.1 Server 分析顯示，SLC7A5 蛋白為無信號(hào)肽蛋白，其所分泌信號(hào)肽的概率低至0.003 2。TargetP 1.1 Server 預(yù)測SLC7A5 蛋白為膜蛋白，主要分布于質(zhì)膜（69.6%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（17.4%）、液泡（8.7%）。通過TMHMM 預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示SLC7A5 是具有11 段跨膜螺旋的跨膜蛋白。

2.2.4 SLC7A5 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 在線蛋白分析系統(tǒng)分析顯示，西農(nóng)薩能奶山羊SLC7A5 蛋白質(zhì)α螺旋可能由141 個(gè)氨基酸形成，延伸鏈可能由124 個(gè)氨基酸形成，無規(guī)則卷曲可能由240 個(gè)氨基酸形成，三者氨基酸含量占比分別為27.92%、24.55%、47.52%。SLC7A5 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分別如圖3 和圖4 所示。

圖3 SLC7A5 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

圖4 SLC7A5 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

2.2.5 SLC7A5 蛋白相互作用預(yù)測 經(jīng)分析得到SLC7A5蛋白相互作用預(yù)測結(jié)果如圖5 所示，SLC7A5 與SLC3A2、SLC38A2、SLC1A5、SLC1A6 等10 種蛋白存在互作關(guān)系。

圖5 SLC7A5 蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測圖

2.2.6 SLC7A5 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹 將克隆的SLC7A5基因轉(zhuǎn)換成氨基酸序列，并在NCBI 上根據(jù)同源性查找山羊、綿羊、牛、水牛、小鼠、人、大猩猩、美洲野牛8種氨基酸序列，通過MEGA7.0 得到蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖6 所示，奶山羊與山羊、綿羊和牛的親緣關(guān)系最近，分別為100%、99.60%、99.01%。

圖6 SLC7A5 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3SLC7A5基因組織表達(dá)譜分析 如圖7 所示，SLC7A5基因以肝臟為對(duì)照組，其在乳腺組織中表達(dá)量最高（P＜0.05），其次是脾臟（P＜0.05），在小腸和腎臟中表達(dá)含量較低（P＞0.05）。對(duì)SLC7A5基因在不同泌乳時(shí)期乳腺組織表達(dá)譜分析（圖8）發(fā)現(xiàn)，以干奶期為對(duì)照組，SLC7A5 在泌乳后期表達(dá)量最高（P＜0.05），其次是前期（P＜0.05），泌乳盛期差異不顯著。

圖7 SLC7A5 在不同組織中相對(duì)表達(dá)量

圖8 SLC7A5 在不同泌乳時(shí)期乳腺組織的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

SLC7A5 是一種鈉非依賴性反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)必需氨基酸參與機(jī)體活動(dòng)[8]。本研究通過克隆所獲得的CDS 序列經(jīng)序列比對(duì)、蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，其編碼蛋白為無信號(hào)肽、具有跨膜結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定堿性蛋白質(zhì)，主要分布于質(zhì)膜。Nakamura 等[11]通過克隆小鼠4F2 L-鏈 SLC7A5 cDNA，推導(dǎo)的氨基酸序列表明4F2 L-鏈至少有11 個(gè)或12 個(gè)螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域，計(jì)算分子量為56 ku，并發(fā)現(xiàn)4F2 L-鏈與最近報(bào)道的大鼠LAT1 高度同源（98% 同源性），為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中特定的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白到質(zhì)膜的“引導(dǎo)分子”。有研究表明，通過對(duì)高、低乳蛋白奶牛乳腺組織切片進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)LAT1 位于乳腺上皮細(xì)胞的整個(gè)質(zhì)膜上，進(jìn)一步揭示LAT1 為乳腺提供了必需氨基酸[12]。在乳蛋白含量較高的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，LAT1 表達(dá)下調(diào)可降低細(xì)胞活力和β-酪蛋白表達(dá)，而過表達(dá)則相反[13]。本研究發(fā)現(xiàn)SLC7A5在乳腺中的表達(dá)量最高，其次是脾臟組織，各個(gè)組織中的表達(dá)存在顯著差異，在乳腺組織的不同泌乳時(shí)期，泌乳后期表達(dá)量最高，其次是前期、盛期及干奶期。在乳腺組織的高表達(dá)表明SLC7A5的生物學(xué)功能很大程度在奶山羊乳腺組織中發(fā)揮作用。研究表明，SLC7A5在嚙齒類動(dòng)物乳蛋白合成中的表達(dá)增加[14]。LAT1 參與泌乳奶牛乳腺中乳蛋白的合成，mTORC1 信號(hào)通路可能是調(diào)控LAT1 表達(dá)的一個(gè)控制點(diǎn)，最終可以用來改變?nèi)榈鞍椎暮铣蒣13]。通過SLC3A2/SLC7A5異二聚體將必需氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中被認(rèn)為是限制EAA激活mTORC1 的速率限制因素，即利用細(xì)胞內(nèi)L-谷氨酰胺作為外排底物來調(diào)節(jié)細(xì)胞外L-亮氨酸的攝取，從而導(dǎo)致mTORC1 的激活[15]。SLC7A5基因在奶山羊小腸、腎臟中的相對(duì)表達(dá)較低甚至不表達(dá)，Nakamura 等[11]在小鼠的腸和腎中幾乎沒有檢測到4F2 L-鏈。而本實(shí)驗(yàn)中SLC7A5在泌乳后期相對(duì)表達(dá)量高，具體調(diào)節(jié)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)SLC7A5 蛋白質(zhì)與SLC3A2、SLC38A2、SLC1A1、SLC1A2、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6、SLC1A7、C1H3orf58、BSG（腫瘤細(xì)胞膠原酶激活因子）10 種蛋白存在互作關(guān)系。SLC7A5 蛋白與SLC3A2 蛋白的互作關(guān)系進(jìn)一步印證了SLC7A5基因通過與SLC3A2形成二聚體參與mTORC1 過程，通過轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)體所需的必需氨基酸進(jìn)而調(diào)節(jié)乳腺乳蛋白的合成[15]。SLC1 家族（高親和力的谷氨酸和中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體）主要參與神經(jīng)興奮的終止和谷氨酸代謝，其中高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAC1（SLC1A1）、GLT1（SLC1A2）、EAAT4（SLC1A6）和EAAT5（SLC1A7）通過3 個(gè)Na+和1個(gè)H+的共轉(zhuǎn)運(yùn)和1 個(gè)K+的反轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)細(xì)胞攝取谷氨酸鹽。因此，它們保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受谷氨酸引起的神經(jīng)毒性。SLC1 家族還包括2 個(gè)中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ASCT1（SLC1A4）和ASCT2（SLC1A5），這2 種 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白促進(jìn)神經(jīng)元和或外周組織細(xì)胞中氨基酸的電中性交換[16]。研究表明SLC7A5主要參與血腦屏障，從而介導(dǎo)營養(yǎng)物質(zhì)和藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）[17]；并且SLC7A5對(duì)維持大腦中支鏈氨基酸（BCAAs）的正常水平至關(guān)重要，大腦中支鏈氨基酸（BCAAs）的失衡可能導(dǎo)致神經(jīng)病態(tài)，如自閉癥譜系障礙[18]。研究發(fā)現(xiàn)，SLC7A5通常與4F2hc/LAT1（SLC3A2/SLC7A5）一起表達(dá)，后者是一種能交換大量中性氨基酸的異源反轉(zhuǎn)運(yùn)體，對(duì)于LAT1 的穩(wěn)定性和定位于血漿膜至關(guān)重要。在多項(xiàng)研究中，這2 種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都與腫瘤生長和mTOR信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)[19-20]，具體地說，LAT-1 輸出的谷氨酰胺通過ASCT2 向細(xì)胞輸入額外的氨基酸營養(yǎng)素（如亮氨酸），后者通過雷帕霉素（mTOR）途徑的哺乳動(dòng)物靶點(diǎn)控制細(xì)胞增殖。這2 種交換物在不同類型的癌癥如三陰性乳腺癌、前列腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）中上調(diào)，已成為腫瘤治療的理想靶點(diǎn)[21]。BGS 作為一種多功能蛋白分子，在炎癥反應(yīng)、胚胎發(fā)育、腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移等多種病理生理過程發(fā)揮重要作用[22]。而研究發(fā)現(xiàn)SLC7A5啟動(dòng)子具有癌基因c-Myc 的典型結(jié)合位點(diǎn)，癌基因的過度表達(dá)導(dǎo)致SLC7A5的表達(dá)增加[21]。目前對(duì)SLC7A5基因的研究主要集中在人類疾病方面，值得注意的是，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能紊亂與多種疾病有關(guān)，這表明許多溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在人類疾病中起到潛在靶點(diǎn)作用，隨著研究的深入，在輸尿管癌、淋巴癌、結(jié)腸直腸癌等人類惡性腫瘤中均已發(fā)現(xiàn)SLC7A5表達(dá)異常升高的現(xiàn)象[23]。

4 結(jié) 論

本研究通過克隆得到西農(nóng)薩能奶山羊SLC7A5基因CDS 區(qū)，全長1 518 bp，編碼505 個(gè)氨基酸，蛋白分子量為55.01 ku。SLC7A5 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位主要在質(zhì)膜上，為無信號(hào)肽、具有跨膜結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定堿性蛋白質(zhì)，有4 個(gè)磷酸化位點(diǎn)；SLC7A5 與SLC1A5、SLC3A2 等10 種蛋白存在相互作用；與山羊、綿羊和牛的親緣關(guān)系最近。SLC7A5基因在奶山羊乳腺組織和泌乳后期高表達(dá)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究SLC7A5基因在奶山羊乳蛋白質(zhì)合成方面的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。