王紅梅，楊劉玥玲，吳逸韜，楊獻康，鄭旭昕，趙旺生

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010）

去整合素-金屬蛋白酶（Disintegrin and Metallopro teinase 28，ADAM28）基因家族成員具有明顯的結(jié)構(gòu)特征，包括前域、金屬蛋白酶和崩解素域以及半胱氨酸域。ADAM 蛋白在細胞黏附與遷移、細胞融合、精子發(fā)生、神經(jīng)發(fā)生等細胞活動中起著至關(guān)重要的作用。哺乳動物附睪是精子獲得動力和受精能力的關(guān)鍵部位，附睪管是一個高度有序和分節(jié)的器官，每一個片段都代表一個獨特的生理分區(qū)。每個小室在上皮細胞內(nèi)都有獨特的基因表達譜，導(dǎo)致特定的蛋白質(zhì)分泌到管腔液中，直接或間接影響精子成熟[1]。

ADAM28 是一種含有催化位點的金屬蛋白酶，已有數(shù)據(jù)表明在小鼠附睪中至少存在2 種ADAM28的剪接形式，其組織印記分析顯示ADAM28在小鼠附睪中以交替剪接的形式高表達[2]，提示其可能在精子成熟過程中發(fā)揮作用。Miyamae 等[3]在獼猴附睪和小鼠附睪的cDNA 文庫中測序，發(fā)現(xiàn)ADAM28在獼猴附睪中表達高，在淋巴結(jié)、胰腺、卵巢和子宮中表達低；在小鼠附睪高表達，在肺、氣管、胃等組織低表達，因此在不同物種中，負責(zé)在生理條件下表達ADAM28的細胞類型是不同的。由于ADAM28在附睪的高水平表達及其能夠分泌CD200 從而參與免疫抑制[4-5]，推測ADAM28參與了精子的成熟和免疫抑制，但沒有直接證據(jù)證明這種可能性，因此有必要對ADAM28基因在牦牛附睪不同區(qū)域的表達進行研究。本研究利用克隆手段獲得ADAM28基因的CDS 區(qū)，并對其進行生物信息學(xué)分析，通過熒光定量檢測其在附睪組織中的表達，以期為探討高原動物的生殖機制提供基本數(shù)據(jù)，同時為研究ADAM28基因在牦牛附睪上皮細胞中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 四川省阿壩州紅原縣屠宰場采集3 頭成年且年齡相近、體格相似、身體健康的公牦牛的睪丸。Hanks 溶液漂洗3 次將附睪從睪丸中分離出來，分為附睪頭、附睪體、附睪尾，置于凍存管中迅速放入液氮中冷凍保存。利用PCR（qPCR）技術(shù)，以內(nèi)參基因UXT作為對照基因，以附睪頭作為對照組，附睪體和附睪尾部作為處理組，運用2-△△Ct方法可計算出ADAM28基因在附睪組織頭、體、尾的相對表達量，觀察ADAM28基因在牦牛附睪組頭、體、尾3 個不同區(qū)段中的表達情況。

1.2 實驗方法

1.2.1 牦牛附睪組織總RNA 的提取 按照Trizol 試劑說明書提取牦牛附睪組織3 個不同區(qū)段的總RNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性，SpectraMax Quick Drop 超微量分光光度計檢測RNA 質(zhì)量，并保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 引物設(shè)計及克隆 牦牛ADAM28基因全長2 447 bp，包含20 個外顯子，其CDS 區(qū)有2 235 bp 編碼744 個氨基酸。利用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計牦牛ADAM28基因的PCR 克隆引物：ADAM28-F：5'-ATGGAGATCAATGTGGAC-3'，ADAM28-R：5'-TGGCAAACAATAGTAAGG-3'，以牦牛附睪組織逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板進行PCR 擴增，采用20.0 μL擴增體系：DNA 聚合酶10.0 μL，雙蒸水7.0 μL，混勻的上下游特異性引物2.0 μL(10 μmol/L)，附睪頭、體、尾的cDNA 各加1.0 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 4 min；94℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s；共循環(huán)40 次，后72℃延伸2 min。將產(chǎn)物電泳檢測后進行DNA 的純化并與目的片段和載體連接，轉(zhuǎn)化及鑒定后送成都擎科梓熙生物公司進行測序。

1.2.3 ADAM28 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析 利用軟件BioXM 2.6 分析牦牛ADAM28 的核苷酸和氨基酸序列；利用在線軟件EXPASY（https://web.expasy.org/protparam/）分析ADAM28 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；利用NCBI 的BLAST 功能比對氨基酸同源性，MEGA 6.0軟件對其系統(tǒng)進化樹進行構(gòu)建，其他相關(guān)生物學(xué)的預(yù)測參考胡斐等文獻中介紹的方法[16]。

1.2.4 熒光定量PCR 利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計ADAM28基因及內(nèi)參基因UXT的特異性定量引物，ADAM28-F：5'-TTGCCTCTTTAATGTCCC-3'，ADAM28-R：5'-GCATTCTCCTAACGCACA -3'；UXT-F：5'-TGTGGCCCTTGGATATGGTT-3'，UXT-R：5'-GGT TGTCGCTGAGCTCTGTG-3。熒光定量操作方法按照生工生物工程（上海）股份有限公司的2×SG Fast qPCR Master Mix 試劑盒說明書進行，反應(yīng)體系10.0 μL：2×SG Fast qPCR Master Mix 5.0 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），PCR-grade water 3.1 μL，模 板DNA為0.5 μL，ddH2O 0.6 μL，以每樣3 個重復(fù)為對照。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 3 min，95℃ 2 s，60℃ 25 s；40個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 牦牛ADAM28基因克隆產(chǎn)物 克隆結(jié)果顯示，所篩選的牦牛ADAM28載體經(jīng)過測序分析后可知產(chǎn)物片段長度為2 336 bp，其中包含牦牛ADAM28基因的CDS 序列2 235 bp，共編碼744 個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。

2.2 牦牛ADAM28 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) ADAM28 氨基酸分子式為C3643H5727N1005O1125S64，分子量為83.66 ku，總氨基酸數(shù)744，其中賴氨酸含量最高，占總氨基酸數(shù)的8.7%，其次為亮氨酸，占7.0%，第三為絲氨酸，占6.9%，色氨酸含量最低，占1.3%。其負電荷殘基（Asp+Glu）和正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)分別是94和90，等電點為6.58，總親水系數(shù)（GRAVY）為-0.479，脂肪系數(shù)值為69.56。不穩(wěn)定性系數(shù)為36.12，蛋白質(zhì)分類為穩(wěn)定。

2.3ADAM28同源性 牦牛ADAM28核苷酸序列與綿羊（登錄號：XM_027964322.1）、山羊（登錄號：XM_005684210.3）、白尾鹿（登錄號：XM_020900956.1）、野豬（登錄號：XM_005670434.3）和鼠耳蝠（登錄號：XM_015569247.1）的同源性分別為96.27%、96.29%、95.18%、84.71%、83.03%（圖1），可知牦牛與山羊、綿羊親緣關(guān)系較近，符合物種進化規(guī)律。

圖1 ADAM28 基因的系統(tǒng)進化樹

2.4 牦牛ADAM28 蛋白的結(jié)構(gòu) 利用NeTPhos 3.1 Server 預(yù)測ADAM28 蛋白磷酸化位點顯示有絲氨酸31個、酪氨酸13 個、蘇氨酸22 個。利用ProtScale 分析其親疏水性（圖2），最大值3.622 在第694 個位點上，最小值-3.622 在第233 個位點上；ADAM28 整體為親水性蛋白，這與其理化性質(zhì)預(yù)測相符。由SOPMA 軟件分析ADAM28 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，其蛋白質(zhì)序列由744個氨基酸組成，122 個處于α螺旋區(qū)，占16.40%；154個在延伸鏈結(jié)構(gòu)，占20.70%；40 個位于β轉(zhuǎn)角區(qū)，占5.38%；428 個處于無規(guī)則狀態(tài)，占57.53%；利用TMHMM 2.0 分析其跨膜區(qū)（圖3），牦牛ADAM28蛋白的676～698 位氨基酸之間形成跨膜螺旋區(qū)。采用SignalP 4.1 Server 預(yù)測ADAM28 蛋白質(zhì)信號肽情況（圖4），結(jié)果顯示牦牛ADAM28 蛋白不存在信號肽序列，經(jīng)Softberry 預(yù)測，牦牛ADAM28 蛋白質(zhì)亞細胞定位于細胞質(zhì)膜上。

圖2 ADAM28 親疏水預(yù)測圖

圖3 牦牛附睪ADAM28 蛋白結(jié)構(gòu)域圖

圖4 牦牛附睪ADAM28 蛋白信號肽預(yù)測

2.5 牦牛附睪不同區(qū)域的基因表達 如圖5 所示，ADAM28基因在附睪組織不同區(qū)段中的表達差異極大（P＜0.01），其中表達量最高的部位為頭部，附睪體部和尾部中表達量較低。

圖5 ADAM28 基因在牦牛附睪不同部位的相對表達情況

3 討 論

ADAMs（崩解素和金屬蛋白酶）是一個跨膜和分泌蛋白家族，通過對細胞黏附、遷移、蛋白水解和信號傳導(dǎo)作用在調(diào)節(jié)細胞表型中發(fā)揮重要作用[6]，同時是精子和卵子黏附融合所需要蛋白的決定基因，這些蛋白存在于精子膜上，在受精時起重要作用[7]。

ADAMs 與整合素相互作用的生理相關(guān)性在受精過程中得到了明確的證明，在豚鼠精子表面發(fā)現(xiàn)的ADAM-1 也稱作PH-30，在小鼠及猴子體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的ADAM-2 也稱為受精-beta[10]，這2 種蛋白質(zhì)在成熟過程中都失去了它們的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域，并直接暴露細胞表面的解體蛋白結(jié)構(gòu)域[11]，基于ADAM1-6在哺乳動物男性生殖器官如睪丸和附睪中的表達[12]，其他的ADAMs也被認為參與了卵-精膜融合受精過程。在ADAM家族中，ADAM1、ADAM-2和ADAM-3在調(diào)節(jié)受精過程中起關(guān)鍵作用，但并不依賴于其黏附和融合潛能[13]。實驗發(fā)現(xiàn)，缺乏ADAM-1和ADAM-2的精子在遷移過程中都有缺陷，但細胞黏附和融合過程只有微小的改變，而ADAM-2 和ADAM-3 蛋白質(zhì)復(fù)合物對于精子從子宮到輸卵管的體內(nèi)遷移至關(guān)重要[14]。

本研究克隆獲得牦牛ADAM28序列長2 247 bp，CDS 區(qū)有2 235 bp，氨基酸為744 個，ADAM28親緣距離是從偶蹄目到食肉目到嚙齒目，進化樹演變同動物分類學(xué)規(guī)律演變一致。其蛋白質(zhì)帶負電，且GRAVY 為負值，因此牦牛ADAM28 編碼的是帶負電的穩(wěn)定的親水性蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)該蛋白磷酸化位點有66 個，為研究其磷酸化提供了思路，同時蛋白結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則狀態(tài)為主，并在其基礎(chǔ)上延伸，預(yù)測其跨膜域時，ADAM28 蛋白的第676～698 位氨基酸之間形成跨膜螺旋區(qū)，但SignalP 4.1 預(yù)測其信號肽發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有信號肽的存在，其以亞細胞定位于細胞質(zhì)膜上。在牦牛整個附睪中均檢測到ADAM28但附睪頭組織中ADAM28水平遠高于附睪體和附睪尾，與ADAM 家族其他成員不同，ADAM28 蛋白不具有典型的前蛋白轉(zhuǎn)化酶的裂解位點[2]，ADAM28 通過細胞表面表達的成熟跨膜蛋白對前結(jié)構(gòu)域的自催化去除而被激活，作為膜錨定蛋白，ADAM28 的自催化活性已得到驗證[17]，ADAM28的表達與sCD200（與免疫抑制有關(guān)）顯著相關(guān)，已確定存在2 種ADAM28 的替代形式，即膜結(jié)合形式的ADAM28-m 和分泌形式的ADAM28-s，其中膜結(jié)合形式的ADAM28-m 在釋放CD200 過程中起重要作用，因此推測ADAM28在精子成熟和免疫抑制方面起重要作用[15]。

在男性不育癥患者的精液中檢測到多個ADAM基因缺失或不表達，而ADAM家族基因在生育過程中可能存在重要作用[7]，推測其在牦牛附睪體部和尾部的低表達可能在牦牛生殖生理過程中起重要作用，但ADAM28在雄性生殖過程中的機制還需后續(xù)進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆牦牛ADAM28基因，同時發(fā)現(xiàn)ADAM28 蛋白為穩(wěn)定的帶負電蛋白，具有親水性，存在跨膜結(jié)構(gòu)域；經(jīng)過qPCR 技術(shù)檢測，ADAM28在牦牛附睪組織表達分布不均，附睪頭的表達顯著高于附睪頸和附睪尾。本研究初步對牦牛的ADAM28在牦牛附睪組織的不同表達進行了探索，將為牦牛精子成熟的機制提供一定的基礎(chǔ)資料，同時為進一步研究ADAM28基因在牦牛附睪上皮細胞中的功能奠定基礎(chǔ)。