劉玲玲，孟 軍，菲茹扎，王 瓊，曹 行，劉武軍

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

毛色是動物的一種重要特征，其能夠在偽裝、模仿、社會交流和抵御太陽輻射有害影響等方面保護(hù)動物[1]。毛色還與某些動物疾病有關(guān)，例如銀色馬的先天性眼異常綜合癥[2]。人類對毛色具有偏好性。20 世紀(jì)50 年代初，花馬僅出現(xiàn)在愛爾蘭，因英國人對此毛色的馬匹不感興趣，無法引入英國，但吉普賽人對花馬比較偏愛，且以此馬為親本培育出毛色以黑白相間為主的吉普希凡尼馬品種[3]。決定馬匹毛色的主要因素是黑色素[4]，影響毛色的基因能夠調(diào)節(jié)黑色素的產(chǎn)生與分布，進(jìn)而形成各種各樣的毛色。影響家養(yǎng)動物豬[5]、牛[6]、羊[7]毛色性狀的主要基因及機(jī)制已有相關(guān)研究。Cho 等[8]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析對雜交豬的毛色進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)KIT（V-Kit Hardy-Zuckerman 4 Feline Sarcoma Viral Oncogene Homolog）是影響雜交豬毛色的基因。KIT基因也是決定韓國濟(jì)州島馬與純血馬的雜交后代馬中毛色呈斑點狀的主要基因[9]。Edea 等[6]基于高密度芯片對187 頭埃塞俄比亞牛進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)MITF基因是影響牛毛色呈斑點狀的基因。關(guān)于影響馬毛色性狀的主要基因和突變位點研究也有報道，如Brunberg 等[10]研究發(fā)現(xiàn)PME17基因第11 外顯子處發(fā)生缺失突變導(dǎo)致該處氨基酸排列從精氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，該突變顯示與多種馬品種的銀色表型完全相關(guān)。

為進(jìn)一步鑒別影響馬毛色性狀的主要基因和突變位點，本研究基于馬670K SNP 芯片，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）方法，對控制馬騮毛和栗毛毛色性狀的基因進(jìn)行研究，旨在挖掘影響伊犁馬毛色性狀的關(guān)鍵基因，探究馬毛色性狀的遺傳基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 研究群體包括119 匹伊犁馬（年齡5～7歲），來自伊犁哈薩克自治州昭蘇馬場。

1.2 血樣采集 頸靜脈采血5 mL，枸櫞酸鈉抗凝，-20℃保存。

1.3 DNA 提取及測序 將采集的血樣送至北京博奧公司，提取馬基因組DNA 及芯片測序。

1.4 表型數(shù)據(jù)測定 伊犁馬毛色以栗毛和騮毛居多，根據(jù)毛色分類方法和實驗群體的毛色種類將毛色分為騮毛和栗毛，栗毛對應(yīng)編碼為1，騮毛對應(yīng)編碼為2。

1.5 基因型數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制 利用Plink（v1.9）軟件，對119 個個體及670 796 個SNPs 數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制。實驗剔除了檢出率小于90% 的個體；剔除了分型成功率（call rate）小于90%的染色體位點和等位基因頻率（MAF）小于0.03 的染色體位點。

1.6 群體分層評估 為消除連鎖不平衡對個體間遺傳相關(guān)估計的偏差，選用獨立的SNPs，利用Plink（1.9）進(jìn)行SNPs 篩選，以50 個位點為一個窗口，以5 個位點為步長，r2設(shè)為0.2。利用主成分分析（PCA）方法對群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，應(yīng)用Rv3.4.4 作圖[11]。

1.7 統(tǒng)計分析模型 全基因組關(guān)聯(lián)分析使用Plink1.9 軟件（http://www.cog-genomics.org/plink/1.9/）中的卡方檢驗進(jìn)行Case-Control 設(shè)計。

1.8 多重校正 應(yīng)用Bonferroni 方法進(jìn)行多重校正，并確定全基因組顯著閾值，計算方法是常規(guī)的顯著P值除以檢測的SNP 個數(shù)，對檢驗的SNP 的P＜0.05/N 或P＜1/N 分別表示SNP 達(dá)到基因組水平顯著關(guān)聯(lián)或潛在關(guān)聯(lián)（N 為質(zhì)控后和連鎖不平衡后的獨立SNP 數(shù)目）[12]；即P＜5.19E-7（0.05/96 903）時，SNP 與毛色性狀顯著關(guān)聯(lián)；SNP 的P＜1.03E-5（1/96 903）時，SNP 與毛色性狀潛在關(guān)聯(lián)。

1.9 位置候選基因注釋 利用馬基因組EquCab2.0 序列信息結(jié)合NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、UCSC（http://genome.ucsc.deu/）、Ensembl（http://asia.ensembl.org/index.html）等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，對顯著的SNPs位置進(jìn)行定位，沒有處在基因內(nèi)部的SNPs 標(biāo)記，考慮到標(biāo)記之間的連鎖不平衡，則分別檢索顯著SNP 位點上、下游1 000 kb 范圍內(nèi)的候選基因。通過在線軟件Genecards（www.genecards.org/）和KEGG 來查找和分析候選基因功能。

2 結(jié)果

2.1 毛色性狀表型描述性統(tǒng)計 在本研究的119 匹伊犁馬中，栗毛色的馬匹為41 匹，騮毛色的馬匹為78 匹。

2.2 質(zhì)控結(jié)果 合格的樣本經(jīng)過Affymetrix 的GTC 平臺分型，經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制之后，檢出率＜90%的SNP標(biāo)記有22 649 個，MAF＜0.03 的SNP 標(biāo)記有154 010 個，最終剩余494 137 個SNPs 和119 個個體用于后續(xù)分析；經(jīng)過連鎖不平衡分析，估算的獨立SNP 數(shù)目為107 680，去除未知染色體上的SNP 數(shù)后，獨立SNP 數(shù)為96 903（用于計算Bonferroni 校正P值）。

2.3 群體結(jié)構(gòu) 由圖1 可知，實驗群體不存在分層現(xiàn)象。為保證結(jié)果更準(zhǔn)確，同樣將群體因素作為協(xié)變量加入到全基因組關(guān)聯(lián)分析模型中。

圖1 群體主成分分析圖

2.4 GWAS 結(jié)果 圖2 反映了對應(yīng)毛色性狀顯著相關(guān)的SNPs，且能看到位點在各個染色體上的分布情況。Y值為6.285 所對應(yīng)的線代表全基因組顯著水平閾值，位于此線之上的位點表示其與目標(biāo)性狀相關(guān)性達(dá)到全基因組顯著水平。GWAS 結(jié)果表明，有2 個SNPs 達(dá)到全基因組顯著水平。

圖2 GWAS 曼哈頓圖

2.5 基因注釋結(jié)果 注釋結(jié)果如表1 所示，2 個SNP 共注釋出39 個基因，其中2 個SNP 的共同基因為CPNE7、DPEP1、CDK10、PATA2L、VPS9D1、ZNF276、FANCA、SPIRE2、TCF25、MC1R、DEF8、GAS8，且AX-104199007是顯著性最高的SNP。

表1 毛色性狀基因注釋結(jié)果

2.6 富集分析結(jié)果 基因功能分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)MC1R通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平對酪氨酸酶進(jìn)行調(diào)控，最終形成不同毛色。

3 討 論

隨著高通量測序技術(shù)的革新，GWAS 方法逐漸成為研究哺乳動物基因的主要方法。在牛上，利用GWAS成功找出與生產(chǎn)和繁殖性狀相關(guān)的基因[13-14]；在馬上，目前僅找出與疾病相關(guān)的基因[15]。本研究旨在找出與伊犁馬毛色性狀關(guān)聯(lián)的基因。Sponenberg 等[16]將馬的毛色分為2 類，即黑色和非黑色。Thiruvenkadan 等[4]將毛色分為3 類，第1 類毛色為基礎(chǔ)毛色，即黑色、騮色、栗色；第2 類毛色為稀有毛色，即奶油色、褐色、銀棕色、香檳色；第3 類為以白色為基礎(chǔ)的毛色。韓國才等[17]將毛色分為單毛色和復(fù)毛色兩大類（13 個小分類）。伊犁馬群體中毛色較多的為騮毛和栗毛。本研究將毛色分為騮毛和栗毛，屬于韓國才[17]一書中單毛色的分類。

黑素皮質(zhì)素受體1（MC1R）能夠調(diào)節(jié)產(chǎn)生黑色素細(xì)胞刺激激素（α-Melanocyte Stimulating Hormone，α-MSH），同時它是G-偶聯(lián)蛋白家族受體之一[18]。環(huán)磷酸腺苷cAMP（Cyclic Adenosine 3’，5’-Monophosphate，cAMP）信號通路為真黑素形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路。MC1R 與α-MSH 結(jié)合使cAMP 被激活，升高細(xì)胞內(nèi)的cAMP 水平，隨后激活酪氨酸激酶，從而活化粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及游離核糖體上合成的酪氨酸酶。黑色素細(xì)胞被催化，并且酪氨酸從血液中被攝取，多巴被高爾基復(fù)合體形成，當(dāng)黑色素小體內(nèi)的多巴積累到一定程度后，黑色素被釋放，形成動物的毛色[19]。Agouti 位點編碼刺鼠信號蛋白（ASIP），它能與α-MSH 進(jìn)行競爭性結(jié)合MC1R，使得cAMP 水平下降，減少黑色素含量[20]。本研究得出MC1R基因可能是影響伊犁馬毛色的主要基因之一。根據(jù)NCBI 收錄信息，MC1R基因位于馬3 號染色體，全長1 721 bp，外顯子區(qū)954 bp。在家養(yǎng)動物豬[21]、羊[22]、雞[23]、狗[24]、貓[25]中，關(guān)于MC1R基因的研究較多。Mahmoud[26]研究沙特阿拉伯綿羊品種MC1R基因的DNA 多態(tài)性，在MC1R基因中檢測到5個單核苷酸多態(tài)性（SNPs），顯性Ed 等位基因最常見的單體型（H3）分別與Najdi 和Sawaknee 綿羊的黑色或棕色毛色相關(guān)。在緬甸貓中發(fā)現(xiàn)一種新的毛色，被稱為赤褐色，MC1R基因是影響這一毛色的候選基因[25]。在馬中關(guān)于MC1R基因的研究較少，Marklund 等[27]研究發(fā)現(xiàn)MC1R基因的一個錯義突變（83 bp）與栗色毛的產(chǎn)生有關(guān)。Wanger 等[28]利用限制性TaqI 的方法發(fā)現(xiàn)MC1R基因84 bp（GAC →AAC）處具有突變位點，導(dǎo)致MC1R基因中第2 個氨基酸替換（Asp →Asn），進(jìn)而產(chǎn)生栗毛。Rieder 等[29]研究發(fā)現(xiàn)雜合子的表型為淺棕色，而純合子表型為深棕色。趙姍姍等[30]利用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）對馬MC1R基因多態(tài)性與毛色進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)MC1R基因存在3個多態(tài)位點，在騮毛馬群體中存在EE 和Ee 2 種基因型，栗毛馬中存在ee 和eea2 種基因型。在本研究中雖沒有發(fā)現(xiàn)其他注釋的基因與毛色有關(guān)，但它們可能未被發(fā)掘，后續(xù)將繼續(xù)挖掘。

4 結(jié) 論

本研究首次利用馬670K 高密度芯片對馬毛色性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，經(jīng)過Bonferroni 校正后，發(fā)現(xiàn)2 個與馬毛色性狀顯著相關(guān)的SNPs，注釋出已知與毛色性狀相關(guān)的基因MC1R，為進(jìn)一步的基因功能驗證提供前期基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。