葛麗巖，胡志剛，張慧林，陳 強(qiáng)，劉小林*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西省潼關(guān)安大番鴨育種場，陜西潼關(guān) 714300）

近年來，禽類行業(yè)發(fā)展迅速，肉蛋產(chǎn)品的消費(fèi)比例逐漸提高[1]。黑羽番鴨的肉蛋產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值高，受到廣大消費(fèi)者認(rèn)可[2]。黑羽番鴨原產(chǎn)于南美洲熱帶地區(qū)，在中國經(jīng)過多年馴化和人工選擇，已成為我國優(yōu)良肉用品種。雄性黑羽番鴨成年體重達(dá)3.5～4.5 kg，雌性黑羽番鴨成年體重為2.0～2.7 kg，適合集約化飼養(yǎng)。產(chǎn)肉量和產(chǎn)蛋量決定了黑羽番鴨的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。目前影響產(chǎn)蛋性能的相關(guān)研究大多集中在營養(yǎng)水平、疾病控制以及生長環(huán)境[4-6]等方面，少有從遺傳育種角度研究基因多態(tài)性對產(chǎn)蛋性能的影響。

在育種工作中，為挖掘有效的遺傳標(biāo)記常對某基因的單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）位點(diǎn)與生產(chǎn)性狀之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。例如：周璇等[7]發(fā)現(xiàn)番鴨神經(jīng)肽酪氨酸基因（NPY）的AG 基因型產(chǎn)蛋性能顯著高于GG 基因型和AA 基因型；張杉杉[8]發(fā)現(xiàn)褪黑素受體1B 基因（MTNR1B）多態(tài)性位點(diǎn)（g.9880654 C＞T）和神經(jīng)元特異基因家族成員1 基因（NSG1）多態(tài)性位點(diǎn)（g.63058214 C＞T）均與番鴨300 日齡產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)；牟芳[9]在海蘭褐蛋雞中發(fā)現(xiàn)α1B-腎上腺素受體基因（ADRA1B）和過氧化物酶體增值物激活受體γ輔激活因子1-β基因（PPARGC1B）多態(tài)性位點(diǎn)可作為產(chǎn)蛋性狀的潛在分子標(biāo)記。

抗繆勒氏管激素（Anti-Mullerian Hormone，AMH）在哺乳動(dòng)物繁殖方向研究較多，但在家禽繁殖方向研究甚少。AMH 是TGFβ（Transforming growth factor beta superfamily，TGFβ）超家族配體成員[10]，是由雄性睪丸支持細(xì)胞和雌性卵巢顆粒細(xì)胞分泌的一種糖蛋白[11]。AMH基因位于20 號染色體，全長4 621 bp，包括4 個(gè)CDS 區(qū)，mRNA 長3 478 bp，AMH 蛋白包括670 個(gè)氨基酸，在性別分化以及卵泡發(fā)育中扮演重要角色。Emily 等[12]發(fā)現(xiàn)AMH基因在不孕婦女中存在與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的SNP 位點(diǎn)。在人AMH基因啟動(dòng)子區(qū)存在多態(tài)性位點(diǎn)，該位點(diǎn)的產(chǎn)生導(dǎo)致AMH 蛋白49 位異亮氨酸取代絲氨酸，影響AMH 的生物活性[13]。王莉娜[14]在豬AMH基因外顯子區(qū)發(fā)現(xiàn)了插入的突變位點(diǎn)，攜帶插入位點(diǎn)的母豬產(chǎn)仔數(shù)顯著高于未攜帶插入位點(diǎn)的母豬。呂愛霞等[15]在多囊卵巢綜合癥患者中發(fā)現(xiàn)AMH基因146 bp 處存在G/T 突變，該突變位點(diǎn)與輔助生殖技術(shù)以及輔助生殖技術(shù)激素水平有著重要關(guān)系。AMH通過AMHR2（Anti-Mullerian hormone receptor type 2，AMHR2）抑制卵泡對促卵泡激素（FSH）的敏感性，抑制卵泡的生長發(fā)育[16-18]。禽類排卵依賴于成熟卵泡的數(shù)量，卵泡選擇過程的正常進(jìn)行決定了禽類正常排卵[19]。本研究旨在通過對AMH基因SNP 位點(diǎn)與黑羽番鴨產(chǎn)蛋及體重的關(guān)聯(lián)分析，篩選可靠的遺傳標(biāo)記，為黑羽番鴨育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與性狀測定 本實(shí)驗(yàn)黑羽番鴨來自陜西安大農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司潼關(guān)育種場，選用同一批次相同條件下飼養(yǎng)的籠養(yǎng)黑羽番鴨。記錄黑羽番鴨的產(chǎn)蛋情況，統(tǒng)計(jì)300 日齡產(chǎn)蛋數(shù)（EN300）、280 日齡體重（280W）。隨機(jī)選出186 只籠養(yǎng)黑羽番鴨，翅下靜脈采血。

1.2 DNA 提取和引物設(shè)計(jì) 采用傳統(tǒng)酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，根據(jù)NCBI 中的鴨AMH基因的DNA序列（NC_040065）設(shè)計(jì)PCR 引物，擴(kuò)增AMH基因序列，引物由北京擎科生物科技有限公司西安分公司合成（表1）。

表1 AMH 基因引物信息

1.3 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測 構(gòu)建186 只個(gè)體DNA 混池，用引物AMH1～5 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)總體系20 μL：2×Taq PCR Mix 10 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，DNA 模板（500 ng/μL）2 μL，雙蒸水6 μL；反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，Tm 30 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.4 基因分型 選取適宜的限制性內(nèi)切酶（表2），判定個(gè)體的基因型。酶切總體系10 μL：6 μL PCR 產(chǎn)物、1 μL(10×buffer)、0.2 μL（lounits/uL）限制性內(nèi)切酶、2.8 μL ddH2O。過夜消化，用3%瓊脂糖凝膠電泳分型。

表2 限制性內(nèi)切酶

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 計(jì)算基因頻率以及基因型頻率，進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析并利用SPSS 軟件的一般線性模型進(jìn)行方差同質(zhì)性檢驗(yàn)以及單因素方差分析，單因素方差分析結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNPs篩選 通過測序篩選到3個(gè)SNP位點(diǎn)：g.1731G＞A、g.2044T＞C、g.3531C＞T（圖1），對3 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。

圖1 AMH 基因的SNP 位點(diǎn)鑒定

2.2AMH基因PCR-RFLP 結(jié)果 將186 個(gè)黑羽番鴨血液DNA 樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，用限制性內(nèi)切酶消化目的片段，進(jìn)行酶切分型。其中，g.1731G＞A 可以分為GG、GA、AA 3 種基因型（圖2）；g.2044T＞C 可分為TT、TC、CC 3 種基因型（圖3）；g.3531C＞T 可分為CC、CT、TT 3 種基因型（圖4）。

圖2 g.1731G＞A 電泳圖

圖3 g.2044T＞C 電泳圖

圖4 g.3531C＞T 電泳圖

2.3 SNP 突變位點(diǎn)群體遺傳參數(shù)分析 對AMH基因的基因型頻率、基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、遺傳純和度（Ho）、遺傳雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表3。經(jīng)哈迪溫伯格平衡檢測3 個(gè)位點(diǎn)均處于平衡狀態(tài)，在g.1731G＞A 位點(diǎn)中G 為優(yōu)勢等位基因，AG 為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為AG＞GG＞AA；在g.2044T＞C 位點(diǎn)中，T 為優(yōu)勢等位基因，基因型頻率為CT＞TT＞CC，在產(chǎn)蛋和體重性狀中，CC 為優(yōu)勢基因型；在g.3531C＞T 位點(diǎn)中，C 為優(yōu)勢等位基因，基因型頻率為CC＞CT＞TT。通過計(jì)算遺傳參數(shù)，g.1731G＞A、g.2044T＞C、g.3531C＞T 位點(diǎn)的PIC在0.25～0.50，均為中度多態(tài)，g.1731G＞A 純和度略高，雜合度略低，在群體中等位基因分布不均勻。

表3 AMH 基因群體遺傳參數(shù)

2.4AMH基因多態(tài)性與產(chǎn)蛋性狀和體重的關(guān)聯(lián)分析 將基因型與產(chǎn)蛋數(shù)據(jù)以及體重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表4。在分析結(jié)果中，在g.1731G＞A 位點(diǎn)，番鴨300 日齡時(shí)，AG 基因型產(chǎn)蛋數(shù)顯著高于AA，AG 為優(yōu)勢基因型，280 日齡體重均值約為3.1 kg，在不同基因型之間的體重均值無顯著差異，A/G 突變和體重不相關(guān)。在g.2044T＞C 中，CC 基因型產(chǎn)蛋數(shù)顯著高于TC 和TT 型，CC 型體重顯著高于TT 型，CC 為優(yōu)勢基因型。在g.3531C＞T 中，3 種基因型的平均產(chǎn)蛋數(shù)約為44 枚，體重約為2.6 kg，不同基因型的產(chǎn)蛋數(shù)和體重均值無顯著差異。

表4 AMH 基因型與產(chǎn)蛋數(shù)和體重的相關(guān)分析

3 討 論

AMH 是TGFβ超家族成員，其主要受體為TGFβI 型受體和TGFβII 型受體[20]，與受體結(jié)合后主要通過Smad、MAPK、PI3K/Akt 等多種途徑發(fā)揮作用[9]。AMH 由生長中卵泡的顆粒細(xì)胞分泌，在原始卵泡啟動(dòng)中起抑制作用。若卵巢中AMH 不表達(dá)，會導(dǎo)致卵巢儲備過早耗盡[21]，推測AMH 與黑羽番鴨繁殖性能有著密切關(guān)系。一些研究證明荷斯坦母牛中AMH 的基因組遺傳力與繁殖性狀有著重要聯(lián)系[22-24]。AMH 水平在許多哺乳動(dòng)物[25-29]中已經(jīng)成為預(yù)測卵巢儲備的代表。

研究基因的單核苷酸多態(tài)性引起的氨基酸變異對理解基因型和表型之間的關(guān)系具有重要意義[30]。本實(shí)驗(yàn)對AMH基因在黑羽番鴨中進(jìn)行SNP 鑒定，只檢測了5'UTR 以及CDS 區(qū)和3'UTR 的SNP 位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)SNP 位點(diǎn)。根據(jù)哈迪溫伯格平衡定律檢測，g.1731G＞A（CDS 區(qū)）、g.2044T＞C（CDS 區(qū)）、g.3531C＞T（3'UTR）位點(diǎn)處于平衡狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中，對AMH基因在CDS區(qū)域的SNP（g.1731G＞A、g.2044T＞C）位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)g.1731G＞A 位點(diǎn)G（GTA）突變至A（ATA）導(dǎo)致AMH編碼的第280 個(gè)氨基酸由纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼?。薄秀梅等[31]研究發(fā)現(xiàn)MEKK3 中K391 的氨基酸突變引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變。鎖培蘇等[32]在卵巢早衰患者中發(fā)現(xiàn)AMH 蛋白第372 位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)槔野彼?，該位點(diǎn)的突變與卵巢早衰具有相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)對AMH 的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與產(chǎn)蛋性狀和體重性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，同時(shí)關(guān)注SNP 位點(diǎn)的產(chǎn)生是否導(dǎo)致氨基酸的變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AA 基因型的平均產(chǎn)蛋數(shù)顯著低于AG 基因型，AA 型個(gè)體表型處于劣勢，AG 型個(gè)體表型處于優(yōu)勢，為黑羽番鴨育種工作提供理論參考。通過expasy.org 網(wǎng)頁分析突變前后的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，G 變?yōu)锳 導(dǎo)致纈氨酸含量由5.7%變?yōu)?.5%，異亮氨酸含量由11% 變?yōu)?2%，這2 個(gè)氨基酸均為疏水性氨基酸，突變前后總平均親水性不變，AMH編碼的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)均為54.01（將不穩(wěn)定系數(shù)小于40的蛋白判定為能夠在體外穩(wěn)定存在），可能間接影響了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，AMH基因的單核苷酸突變可能影響了AMH 和AMHR2 互作[33]。本研究中，g.1731G＞A 位點(diǎn)中AG 基因型的產(chǎn)蛋數(shù)均值顯著高于AA 型，但對體重的影響不顯著，在g.2044T＞C 位點(diǎn)中，CC 基因型在產(chǎn)蛋和體重性狀上都有顯著優(yōu)勢，番鴨中g(shù).1731G＞A和g.2044T＞C 突變位點(diǎn)可作為遺傳標(biāo)記參考基因。通過對AMH基因的5'UTR 及3'UTR 區(qū)域的SNP 檢測，發(fā)現(xiàn)g.3531C＞T 位點(diǎn)位于3'UTR 區(qū)，CC 基因型頻率顯著高于TT 型，但該位點(diǎn)突變對產(chǎn)蛋和體重的影響不顯著。

本研究中g(shù).1731G＞A 和g.2044T＞C 的突變位點(diǎn)均與產(chǎn)蛋性狀相關(guān)，g.2044T＞C 的突變位點(diǎn)與體重相關(guān)，AG 基因型和CC 基因型可作為新一代黑羽番鴨育種的候選基因型，但由于產(chǎn)蛋和體重性狀受到多種因素影響，所以g.1731G＞A 位點(diǎn)和g.2044T＞C 位點(diǎn)對AMH 蛋白功能的影響有待深入研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AMH基因存在g.1731G＞A、g.2044T＞C、g.3531C＞T 3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)。其中，g.1731G＞A的AG 和g.2044T＞C 的CC 為優(yōu)勢基因型。g.1731G＞A和g.2044T＞C 與產(chǎn)蛋性狀相關(guān)，g.3531C＞T 與產(chǎn)蛋性狀不相關(guān)，g.2044T＞C 與體重性狀相關(guān)，g.1731G＞A 和g.3531C＞T 與體重性狀不相關(guān)。在哺乳動(dòng)物中，AMH已經(jīng)被證實(shí)可以作為預(yù)測卵巢儲備的標(biāo)志物，但其是否可以作為黑羽番鴨繁殖性能的遺傳標(biāo)記，還有待生產(chǎn)實(shí)際進(jìn)一步驗(yàn)證。