任艷華,李 慧， 張雋美， 張玉茹＊

（1.河南師范大學水產學院，河南新鄉(xiāng)453007；2.河南省水產動物養(yǎng)殖工程技術研究中心，河南新鄉(xiāng)453007）

近年來，隨著生產力的發(fā)展，重金屬加重了對河流、湖泊等水體的污染程度，成為水生生態(tài)環(huán)境的持久性污染物。其中，鎘作為一種有毒的重金屬，通常以離子的形式存在于環(huán)境中，由于其半衰期長，不易被降解，會隨著廢水等進入湖泊河流等水環(huán)境并進入生物鏈，并在人及動物體內蓄積，對人及動物的健康帶來極大的危害。已有研究表明，長期暴露在鎘等重金屬污染水體中的魚類，呈現代謝紊亂、免疫功能紊亂、肝臟和腎等器官病變等癥狀[1,2]。2012年，研究者對東北三省3種魚的肌肉樣品檢測時發(fā)現，鎘在鯉魚、草魚、鯽魚中超標，超標率高達1.1%，其中鯉魚肌肉中鎘平均含量為0.01 mg/kg[3]，其含量接近珠江三角洲鯉魚中鎘的平均含量（0.01 mg/kg）[4]，低于太湖中鯉魚肌肉鎘的平均含量（0.014 mg/kg）[5]?？梢?，魚體內鎘含量存在超標現象，鎘對魚類生長、代謝和免疫功能等的影響已引起人們的重視。但是，目前的研究多集于鎘對水生動物免疫毒性的研究，較少的從魚類脂代謝的角度進行研究，亟需深入研究。

2018年，全球魚類產量大約為1.79億噸，8210萬噸來自水產養(yǎng)殖，其中鯉魚（Cyprinus carpio）的養(yǎng)殖量達到了418.95萬噸[6]。鯉因其體態(tài)豐滿，肉質肥厚，細嫩鮮美，營養(yǎng)豐富而成為我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類，由于它們對污染的水環(huán)境具有較強的抵抗力，而被用作了解環(huán)境污染的生物指標物種[7,8]。據此，本實驗通過模擬水體中鎘的濃度，進行為期30 d的Cd2+暴露實驗，評價鎘對鯉肝體比、臟體比、肝臟脂肪蓄積、肝臟和肌肉脂肪酸成分和含量的影響，以期為防治水體鎘污染提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗選用平均體重約80 g的健康鯉于河南師范大學水產學院養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)2周開始正式實驗。參照中國漁業(yè)水質標準(GB11607-89)規(guī)定鎘濃度不超過0.005 mg/L。確定Cd2+的實驗組濃度分別為0.005 mg/L Cd2+、0.05 mg/L Cd2+、0.5 mg/L Cd2+，另設一個對照組（清水）。將馴化后的鯉魚隨機平分為4組，每組3個重復，每3 d換1/2的水，每次加入不同濃度的CdCl2。每天兩次按照鯉魚體重的1.5%進行投喂商業(yè)顆粒飼料，剩余的飼料殘渣撈出，水溫在（18±2）℃，pH控制在7.0±0.1之間，飼養(yǎng)30 d。

1.2 樣品收集

實驗結束后，用濃度為40 mg/L的MS-222對所有魚進行麻醉，每桶隨機選取5尾進行稱重和體長測量，并解剖分離出內臟，液氮速凍后置于-80℃保存，用于不同組織脂肪酸的測定。另外，每桶隨機挑取3尾，取其肝臟，一部分置于4%多聚甲醛溶液中用于蘇木精-伊紅（HE）染色切片的制作，另一部分用于油紅染色切片的制作。

1.3 肝體比和臟體比測定

生長及生物學性狀計算公式：

肝體比（hepato-somatic index，HIS，%)=Wl/Wt×100

臟 體 比 （viscera-somatic index，VSI，%）=Wv/Wt×100

式中，Wt為終末體質量(g)，Wl為肝臟濕重（g）。

1.4 組織切片制作

每桶隨機挑取3尾，取其肝臟，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，參照《臨床病理學技術》中的操作規(guī)范，對鯉肝臟組織樣品進行石蠟包埋、切片，進行蘇木精－伊紅(HE)染色及油紅染色，并于顯微鏡下閱片觀察鯉肝組織的形態(tài)變化。

1.5 不同組織脂肪酸含量分析

每個樣品稱取2.0-3.0 g，每組做4個重復。用氯仿/甲醇(2:1,v/v)溶液萃取樣品中脂質，使用美國Agilent 7890B氣相測譜儀（配置100 m HP-88石英毛細管柱）測定肝臟和肌肉全脂的脂肪酸成分，采用百分比的方法計算組織中脂肪酸含量。

1.6 數據處理

使用EXCEL 2019分析處理實驗數據，使用SPSS 22.0的單因素方差對生長性能指標數據進行顯著性檢驗和多重比較；此外，由于脂肪酸提取過程中少量實驗數據缺失，致使各組織脂肪酸數據與基因表達數據個數不完全一致（非均衡數據），無法用方差分析進行統(tǒng)計分析，因此使用SAS9.0軟件包對肌肉和肝臟脂肪酸成分進行最小二乘分析和多重比較，不同組織脂肪酸成分表示為最小二乘均數±標準誤(LSMEAN±SE)。

2 結果與分析

2.1 鎘對鯉肝體比及臟體比的影響

肝臟是魚類代謝的主要器官，肝體比和臟體比是毒理實驗中常用的指標，能夠反映臟器的健康狀態(tài)。因此，本實驗測定了鯉的肝體比與臟體比（表1），隨著水體中鎘濃度的增加，肝體比逐漸降低。當水體鎘濃度為0.05 mg/L時，鯉魚的臟體比顯著低于對照組和0.005 mg/L處理組中的對應值。與之類似，當水體中鎘濃度從0.05 mg/L增加至0.5 mg/L時，鯉魚臟體比顯著升高。

表1 鎘暴露對鯉肝體比和臟體比的影響

2.2 鎘對鯉魚肝細胞形態(tài)和脂質蓄積的影響

為了檢測鎘暴露是否會對鯉肝細胞造成損傷以及肝組織脂質蓄積，本實驗取了鯉的肝臟組織，分別使用蘇木精-伊紅（HE）和油紅染色檢測分析鯉肝細胞形態(tài)、肝脂沉積的情況。電子顯微鏡下觀察發(fā)現：與對照組相比，不同濃度鎘暴露之后鯉魚肝細胞邊界清晰，細胞核處于細胞中心位置，肝細胞大小無明顯變化，細胞核大小無明顯變化且肝臟脂滴無明顯增多（圖1）。說明鎘處理并未影響肝臟的脂肪蓄積。

圖1 鎘暴露對鯉肝細胞形態(tài)和脂肪含量的影響(10×40)

2.3 鎘對鯉魚肝臟及肌肉脂肪酸成分及含量的影響

脂肪酸的合成與分解代謝在維持機體穩(wěn)態(tài)過程中起著重要作用，且脂肪酸在脂質的合成、分解和轉化的過程中有重要的調控作用，為了探討鎘暴露對鯉脂肪酸代謝的影響，本實驗分析了不同濃度鎘暴露后鯉關鍵脂代謝組織肝臟和脂肪主要蓄積組織肌肉中的脂肪酸成分和含量。

分析鯉肝臟脂肪酸組成成分發(fā)現（表2，圖2），不同濃度鎘暴露后對鯉肝臟C16:0、C18:1n9、C18:3n6、C18:3n3、C20:0、C20:2、C20:3n6、C20:4n6、C22:6n3、∑SA、∑PUFA/∑SA和∑N6/∑N3均無顯著影響（P＞0.05）；與對照組相比，0.005 mg/L與0.05 mg/L鎘暴露顯著降低了鯉肝臟C14:0的含量；0.005 mg/L組鯉肝內C16:1n7含量增加，但隨著水體中鎘濃度的增加，其含量逐漸降低；0.005 mg/L組鯉肝內C18:1n7含量顯著高于0.05 mg/L組（P＜0.05），但與其他各組差異不顯著（P＞0.05）；0.05 mg/L鎘暴露后，鯉肝內C18:2的含量顯著高于其它組（P＜0.05）；隨水體中鎘濃度的增加，鯉肝內C20:5n3的含量逐漸增加，0.5 mg/L組鯉肝內C20:5n3含量顯著高于對照組和0.005 mg/L組對應含量（P＜0.05）；0.05 mg/L組鯉肝臟∑PUFA的含量顯著高于對照組和0.005 mg/L組（P＜0.05）。

表2 不同濃度鎘對鯉魚肝臟脂肪酸含量的影響

分析鯉肌肉脂肪酸組成成分發(fā)現（表3，圖2），不同濃度鎘暴露后對鯉肌肉C14:0、C16:0、C16:1n7、C18:0、C18:1n9、C18:1n7、C18:2、C18:3n6、C18:3n3、C20:0、C20:2、C20:4n6、∑SA、∑PUFA、∑PUFA/∑SA、∑N6和∑N6/∑N3均無顯著影響（P＞0.05）；0.5 mg/L鎘暴露后，肌肉中C20:3n6的含量顯著高于0.05 mg/L組（P＜0.05），0.005 mg/L和0.05 mg/L組鯉肌肉C20:3n6低于對照組，但并無顯著差異（P＞0.05）；隨水體中鎘濃度的增加，鯉肌肉C22:6n3的含量逐漸增加，0.05 mg/L組鯉肌肉C22:6n3顯著高于對照組（P＜0.05），但當濃度超過0.05 mg/L之后，肌肉中其含量降低。0.5 mg/L組肌肉∑N3含量顯著低于0.05 mg/L組（P＜0.05），0.05 mg/L和0.005 mg/L與對照組鯉肌肉∑N3無顯著變化（P＞0.05）。

此外，分析肝臟和肌肉各對照組中脂肪酸含量發(fā)現，肌肉中C14:0、C16:0、C18:0含量顯著低于肝臟中的含量（P＜0.05）；同時，肌肉中∑SA顯著低于肝臟中的值（P＜0.05）（圖2）。但兩組織中∑PUFA含量差異不顯著。

圖2 鎘對鯉魚肝臟及肌肉脂肪酸成分的影響

3 討論

鎘在自然界中普遍存在，作為人體蛋白質主要來源之一，魚體中的鎘會隨食物鏈最終進入到人體，危害人體的健康。研究發(fā)現，人攝入鎘后，鎘主要蓄積在人體肝臟和腎臟內，并對多種器官造成負面影響。對哺乳動物的研究也發(fā)現，將小鼠的肝細胞進行不同濃度的鎘暴露后，隨著鎘濃度的升高，肝細胞的死亡率逐漸增加[9]。水生動物普遍可以吸收鎘，鎘不僅會對水生生物的生長及存活帶來不利影響，還會對漁業(yè)生產造成阻礙。已有的水生生物研究發(fā)現，1.6 mg/L鎘暴露30 d后，鯽魚肝組織超氧化物歧化酶顯著降低[10]，鎘濃度從0.2 mg/L增加至1.6 mg/L時，鯽魚肝丙二醛（MDA）的含量逐漸增加[11]，表明鎘暴露能夠引起紅鯽脂質過氧化肝損傷，從而損害魚體健康。鎘暴露5周后，雄性食蚊魚肝質量和肝腺指數有所增大，但對雌性食蚊魚無顯著影響[12]。0.025 mg/L鎘暴露12周后，稀有鮈鯽內臟團重顯著降低[13]。

與上述研究不同，本實驗中，隨著水體中鎘濃度的增加，肝體比逐漸降低，當水體鎘濃度為0.05 mg/L時，鯉魚的肝體比顯著低于對照組和0.005 mg/L處理組。且臟體比有類似趨勢。這可能與不同種的魚類對鎘的毒性具有不同的敏感性有關。

此外，經過鎘暴露的小鼠肝臟與對照組小鼠肝臟相比，出現纖維化現象[14]。0.005 mg/L與0.025 mg/L鎘暴露后，稀有鮈鯽肝組織形態(tài)與正常對照組相比無顯著變化，0.05 mg/L時，肝臟開始出現病變[13]。在本實驗中鎘暴露對鯉肝組織形態(tài)結構無顯著變化，推測可能原因為黃河鯉對鎘暴露的耐受強，本實驗中鎘暴露濃度不足以導致肝脂質的蓄積及肝損傷。

鎘暴露對脂肪酸代謝有很大影響，且存在復雜的相互作用。已有研究發(fā)現，鎘(300 mg/L，暴露6周)上調了魚肝臟長鏈脂肪酸延長酶elovl2活性，但這種上調并沒有伴隨著多不飽和脂肪酸的顯著增加，且300 mg/L鎘暴露后并沒有顯著影響虹鱒肝臟脂肪酸含量[15]。上述實驗結果與本實驗中肝臟和肌肉中脂肪酸含量基本相符。