李 泓，王延暉，謝國強(qiáng)，于 瀟，王冰柯，朱文錦

（河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院，鄭州450044）

常溫常壓等離子體 （Atmospheric and Room Temperature Plasma）簡稱ARTP，指能夠在大氣壓下產(chǎn)生溫度在25～40℃之間、具有高活性粒子濃度的等離子體射流，通過照射使生物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及通透性發(fā)生改變，進(jìn)一步引起核酸損傷，最終產(chǎn)生可穩(wěn)定遺傳的變異體。ARTP照射技術(shù)作為一種物理誘變方法，可廣泛用于微生物、動(dòng)物、植物育種，是近年來發(fā)展極為迅速的新技術(shù)。目前，ARTP誘變技術(shù)已成功應(yīng)用于包括細(xì)菌、放線菌、真菌、酵母、微藻等在內(nèi)的六十余種微生物的誘變育種，在微生物進(jìn)化研究和微生物工業(yè)生產(chǎn)方面發(fā)揮著巨大作用；但由于不同生物體生長和結(jié)構(gòu)的差異，該技術(shù)在植物、動(dòng)物體上的應(yīng)用難度較大，研究相對較少。

紅白錦鯉（Cyprinus carpiohaematopterus）是錦鯉中的基礎(chǔ)品種，社會(huì)知名度和認(rèn)可度較高。鯉科觀賞魚養(yǎng)殖技術(shù)較成熟，其生長優(yōu)勢較明顯。紅白錦鯉的顏色較簡單，誘變對顏色的影響較易識(shí)別。本試驗(yàn)通過對紅白錦鯉受精卵進(jìn)行ARTP誘變處理，找出不同照射方案下魚卵孵化和生長情況的差異，進(jìn)而比較最優(yōu)化照射誘變方案，探索通過ARTP技術(shù)進(jìn)行錦鯉誘變育種的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

受精卵來自泌陽縣帝苑錦鯉養(yǎng)殖場。母本為優(yōu)質(zhì)紅白錦鯉，父本為優(yōu)質(zhì)銀鱗紅白錦鯉，親魚均達(dá)到3齡以上，雄魚體長50 cm，雌魚體長55 cm，體重3～3.5 kg。2020年10月14日進(jìn)行人工授精，隨即將受精卵平鋪在網(wǎng)片上，網(wǎng)片及受精卵充氧裝袋后運(yùn)輸至河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)科研試驗(yàn)中心，進(jìn)行ARTP照射試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

受精后6 h左右，在顯微鏡下觀察受精卵發(fā)育程度，當(dāng)大部分受精卵處于原腸胚期時(shí)，開始照射試驗(yàn)。照射時(shí)間和照射強(qiáng)度分別設(shè)置三個(gè)水平，采用雙因素交叉分組，另設(shè)1組為對照組。實(shí)驗(yàn)組編號(hào)見表1。

表1 ARTP照射分組

1.3 出苗培育

照射后的受精卵按順號(hào)移入相同規(guī)格80 cm×40 cm×60 cm水族箱內(nèi)，單獨(dú)孵化飼養(yǎng)，水溫控制在17～20℃，箱內(nèi)放置加溫棒和充氣棒24 h加溫、充氧。3 d后出膜，前3 d投喂蛋黃漿，而后轉(zhuǎn)為豐年蟲。各組保持一致的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件，氣溫轉(zhuǎn)暖后，移入室外5 m×5 m硬化水泥池。統(tǒng)計(jì)各組孵化率和成活率。

2結(jié)果與分析

2.1 總體成活率分析

實(shí)驗(yàn)組與對照組受精卵成活率存在較大的差異，對照組37.43%，試驗(yàn)組10%左右。在試驗(yàn)組與試驗(yàn)組之間，成活率差異不顯著（圖1、表2）。排除由于秋季育苗導(dǎo)致整體成活率不高的因素，通過ARTP照射的受精卵較沒有照射的受精卵折損率為75%，即減產(chǎn)3/4。實(shí)驗(yàn)組受精卵成活率的高低，決定了實(shí)驗(yàn)樣本基數(shù)的大小，可以作為優(yōu)化ARTP照射方案的一項(xiàng)參考依據(jù)。

表2 孵化情況統(tǒng)計(jì)

表3 生長情況統(tǒng)計(jì)（3個(gè)月）

圖1 總成活率圖

2.2 照射強(qiáng)度和照射時(shí)間對成活率的影響

通過比較不同照射強(qiáng)度和照射時(shí)間下的成活率（圖2），發(fā)現(xiàn)不同強(qiáng)度照射下受精卵成活率不穩(wěn)定，差異較大；不同時(shí)間的照射下受精卵成活率相差不大，且趨于穩(wěn)定。因此影響受精卵成活率的因素，照射強(qiáng)度＞照射時(shí)間。在優(yōu)化ARTP照射方案上，可以縮短照射時(shí)間，以主要控制照射強(qiáng)度為手段進(jìn)行誘變照射。

圖2 照射時(shí)間和照射強(qiáng)度對成活率的影響

2.3 突變率的體現(xiàn)

ARTP照射試驗(yàn)的主要目的就是得到能穩(wěn)定生長的突變種，在受精卵孵化后的生長階段，部分個(gè)體因誘變導(dǎo)致發(fā)育畸形，進(jìn)而在孵化后的一段時(shí)期內(nèi)發(fā)生生長中斷，因此通過統(tǒng)計(jì)前三個(gè)月的死亡率，可以一定程度上反映照射產(chǎn)生的突變率。通過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，照射強(qiáng)度越高的實(shí)驗(yàn)組，在生長的第一個(gè)月內(nèi)幼苗死亡率越高，且最高的實(shí)驗(yàn)組死亡率接近70%（圖3）；第二個(gè)月至第三個(gè)月生長趨于穩(wěn)定，死亡現(xiàn)象較少發(fā)生。高畸形率導(dǎo)致了高死亡率的產(chǎn)生，另一方面高畸形率也是增加突變率的體現(xiàn)，因此在本次實(shí)驗(yàn)中，較高強(qiáng)度的照射方案誘變效果更好，可以作為優(yōu)化ARTP照射方案的一項(xiàng)重要依據(jù)。

圖3 第一個(gè)月死亡率對比圖

2.4 照射對生長速度的影響

通過分析前三個(gè)月實(shí)驗(yàn)組與對照組幼苗生長體長情況發(fā)現(xiàn)（圖4）：實(shí)驗(yàn)組生長速度均超過對照組，且在第2個(gè)月較為明顯；實(shí)驗(yàn)組之間的生長速度差異不顯著。生長速度不同可以作為ARTP照射的一項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)，但由于魚苗較小，實(shí)驗(yàn)組各組樣本基數(shù)不一且相對較小，前期的生長情況要與后期成魚的生長情況綜合評價(jià)。

圖4 前三個(gè)月魚苗體長情況

3 討論

綜合分析樣本基數(shù)、突變率和生長情況，第7組表現(xiàn)較優(yōu)，后期將基于該組照射時(shí)間和強(qiáng)度，繼續(xù)優(yōu)化ARTP誘變育種的照射方案。通過此次受精卵ARTP誘變照射試驗(yàn)的實(shí)施，課題組認(rèn)為通過ARTP進(jìn)行觀賞魚誘變育種是可行的。但是有別于微生物的ARTP誘變育種，動(dòng)物或植物的常溫常壓等離子誘變更多的是關(guān)注試驗(yàn)過程對個(gè)體的影響，其不確定因素更多，需要進(jìn)一步探索誘變研究的規(guī)律和操作規(guī)范。

同時(shí)，通過本次試驗(yàn)，也發(fā)現(xiàn)了一些問題。一是秋季育苗的問題。雖然理論上秋季育苗錦鯉是可行的，但是在實(shí)際操作中難度很高，需要完備的硬件設(shè)施、優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)材料和成熟的人工授精技術(shù)。二是幼苗的體質(zhì)問題。此次試驗(yàn)幼苗的體質(zhì)相對較弱，雖然進(jìn)行了對照組實(shí)驗(yàn)對比，但對數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性有一定的影響。三是實(shí)驗(yàn)樣本過少。對試驗(yàn)結(jié)果的預(yù)估不足，導(dǎo)致最終成活的實(shí)驗(yàn)樣本過少，不能形成穩(wěn)定的數(shù)據(jù)構(gòu)架，導(dǎo)致如2#、4#存在較大誤差的實(shí)驗(yàn)組情況。四是試驗(yàn)起步較晚。對實(shí)驗(yàn)組和對照組成魚的觀察是此次試驗(yàn)的重要內(nèi)容，但目前受季節(jié)影響，魚苗生長速度較慢，試驗(yàn)周期過長。下一步工作重點(diǎn)，總結(jié)評估試驗(yàn)效果，進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)施方案，在春、夏季開展試驗(yàn)，以彌補(bǔ)此次試驗(yàn)的遺憾和不足。