王 睿,周圣宜,翁露璐,史哲毅,陳浩宇,周海園,徐國軒,白 莉

(南京醫(yī)科大學康達學院:1.臨床醫(yī)學部;2.康復醫(yī)學部;3.病原生物學與免疫學教研室,江蘇 連云港 222000)

痤瘡是一種由多因素致病的毛囊皮脂腺疾病，其中微生物的定植被認為是影響?zhàn)畀彴l(fā)病的關鍵因素[1]。皮膚表面本身即存在大量的常居菌和暫居菌，痤瘡的產(chǎn)生是否是因暫居菌的感染，或是因皮膚常居菌中某些條件致病菌的失衡所致，目前尚無定論。本研究選取鹽城市第一人民醫(yī)院皮膚科門診痤瘡患者17例作為研究對象，分別收集患者痤瘡皮損局部體表樣本，并選取17例健康人作為對照組，分別進行需氧、厭氧培養(yǎng)，采用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對培養(yǎng)分離出的細菌進行鑒定，對比兩組樣本之間菌群指標的差異，探究其在痤瘡發(fā)病過程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 17例痤瘡皮損局部體表樣本，采自2018年7月至8月鹽城市第一人民醫(yī)院皮膚科確診的痤瘡患者，根據(jù)《中國痤瘡治療指南》[2]的痤瘡分級標準分為輕度(Ⅰ級)、中度(Ⅱ、Ⅲ級)痤瘡患者；患者年齡12～34歲，平均(19.7±5.7)歲；男10例，女7例。17例健康人群皮膚菌群樣本，選擇蘇北某高校學生，平均年齡(19.6±1.2)歲，男7例，女10例。排除標準：過去2個月內(nèi)局部或系統(tǒng)使用過抗生素、激素、維A酸類藥物及免疫抑制劑；有胃腸道疾病、呼吸道疾病及其他系統(tǒng)性疾病，有其他皮膚疾病。

1.2方法

1.2.1實驗儀器及材料 血瓊脂平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，厭氧產(chǎn)氣袋(法國生物梅里埃公司)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海索譜儀器有限公司)，MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀(法國生物梅里埃公司；連云港市第一人民醫(yī)院高新院區(qū)檢驗科提供)。

1.2.2實驗方法

1.2.2.1菌群標本采集 用無菌棉拭子蘸取無菌生理鹽水對痤瘡患者取樣部位進行清潔，去除面部灰塵；選擇痤瘡皮損狀態(tài)完好，未破損區(qū)域，使用一次性采樣拭子用力旋轉擦拭皮損周圍皮膚進行取樣。健康人皮膚取樣部位選擇被試者額頭無皮損區(qū)域皮膚，方法同痤瘡患者皮損周圍取樣。將所取樣本分別接種到2塊血瓊脂平板上。

1.2.2.2細菌的培養(yǎng)、分離和鑒定 將每份樣本分別進行厭氧、需氧培養(yǎng)，其中厭氧培養(yǎng)的血瓊脂平板放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋中。厭氧產(chǎn)氣袋可消耗袋中的氧氣，釋放出二氧化碳，形成適宜的厭氧培養(yǎng)環(huán)境。樣本需氧培養(yǎng)24 h，厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單個菌落分離純化培養(yǎng)。純化后的菌株使用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀，選擇VITEK MS質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進行鑒定。

2 結 果

2.1痤瘡患者皮損局部體表菌群檢測結果 17例痤瘡患者共分離出7種39株細菌。主要檢出菌種為表皮葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌、頭狀葡萄球菌。見表1。

表1 痤瘡患者皮損局部體表菌群檢測結果(n=39)

2.2健康人皮膚菌群檢測結果 17例健康人皮膚體表共分離出18種共53株細菌。主要檢出菌種為表皮葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌。見表2。

表2 健康人皮膚體表菌群檢測結果(n=53)

3 討 論

痤瘡的發(fā)病機制并不完全清楚，目前普遍認為痤瘡發(fā)病與內(nèi)分泌失調(diào)及微生物在毛囊皮脂腺內(nèi)定植等因素有關[3-4]。而隨著微生態(tài)學的發(fā)展，人們開始關注皮膚微生態(tài)失衡與痤瘡發(fā)病的相關性。本研究中，表皮葡萄球菌是痤瘡患者皮損局部體表和健康人皮膚表面樣本中絕對優(yōu)勢菌種，而痤瘡丙酸桿菌在痤瘡組樣本中的檢出率較高(χ2=4.25，P<0.05)。痤瘡丙酸桿菌可能是主要的痤瘡致病菌，與相關研究結果一致[5]。

另一方面，本研究中健康人的皮膚檢出細菌種類數(shù)明顯多于痤瘡患者(t=2.167，P<0.05)，皮膚表面菌群的高多樣性可能于皮膚的健康息息相關。YANHAN等[6]研究發(fā)現(xiàn)，表皮葡萄球菌會通過發(fā)酵甘油等途徑抑制痤瘡丙酸桿菌的過度生長。而對于同樣是微生物感染導致的炎癥性疾病——特應性皮炎(AD)，KONG等[7]研究發(fā)現(xiàn)，AD近期治療組及健康組皮膚菌群多樣性均高于患病組，并指出AD嚴重程度的惡化與皮膚菌群多樣性的降低之間有很強的相關性。此外，還發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌在AD爆發(fā)期與金黃色葡萄球菌同時流行，該一致性可能是表皮葡萄球菌的一種補償作用機制，以控制金黃色葡萄球菌的增加。TERUAKI等[8]發(fā)現(xiàn)，具有抗菌活性的凝固酶陰性葡萄球菌(CoNS)菌株在健康人群中很常見，但在病例組中很少見，同時還發(fā)現(xiàn)將抗菌CoNS重新引入患者體內(nèi)，可以減少金黃色葡萄球菌的定植。由此可以看出，皮膚細菌會通過相互作用，以及與其他致病菌和人體細胞相互作用，營造出一個相對健康穩(wěn)定的皮膚微生態(tài)[9]。

最近已有研究通過高通量測序?qū)τ陴畀徝娌科つw微生物群落變化進行研究，發(fā)現(xiàn)痤瘡面部皮損區(qū)與無皮損局部體表的細菌多樣性較健康組顯著下降，主要與痤瘡丙酸桿菌與表皮葡萄球菌的顯著性上升有關[10]。本研究中，雖然無法直接證明健康組的皮膚多樣性高于痤瘡組，但健康組患者所檢出的菌株種數(shù)檢出數(shù)要明顯高于痤瘡組，在一定程度上可以說明健康人皮膚菌群的高多樣性。有研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡患者皮損體表與本人無皮損局部體表的菌群組成也相似[9]，這或許可以說明痤瘡的發(fā)病可能與致病菌的繼發(fā)感染有關，而皮膚體表的菌群變化也可能預示著痤瘡進一步發(fā)展。目前，對于痤瘡體表皮膚的微生態(tài)的研究還較少，皮膚微生態(tài)的失衡及皮膚菌群多樣性的下降可能與痤瘡的發(fā)生、發(fā)展相關。本研究樣本量相對較小，這是本研究的一項不足之處，結論還需更大樣本量證實。

本研究使用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀進行菌種鑒定，能夠較準確地將可培養(yǎng)的細菌鑒定到菌種，可以更好地研究不同菌種對于人體健康的潛在影響，而本研究的局限性也在于不能研究無法培養(yǎng)的細菌?；趯?6SrDNA的高通量測序，能對不可培養(yǎng)細菌進行鑒定，但其大多只能鑒定到屬，只有部分可以鑒定到種水平，并且成本較高，在臨床中無法大規(guī)模使用，而MALDI-TOF-MS與傳統(tǒng)的微生物表型檢測和生化檢測方法相比，具有準確度高、靈敏度高、成本低、快速高效等優(yōu)點，有良好的臨床使用前景[11]，因此使用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀進行菌種鑒定也是有必要的。而未來的深入研究可結合16SrDNA測序、Shotgun等技術，以全面地研究皮膚菌群多樣性與皮膚健康的聯(lián)系。

總之，表皮葡萄球菌是痤瘡患者皮損局部體表和健康人皮膚表面樣本中絕對優(yōu)勢菌種；丙酸桿菌尤其是痤瘡丙酸桿菌在各類樣本中檢出率較高，其可能是主要的痤瘡致病菌；痤瘡患者皮膚菌群檢出種數(shù)相較于健康人明顯下降；皮膚微生態(tài)的失衡及皮膚菌群多樣性的下降可能與痤瘡的發(fā)生、發(fā)展相關。目前，對于皮膚微生態(tài)的研究還處在起步階段，本研究通過對于痤瘡皮膚菌群組成的初步探究，引出了皮膚微生態(tài)與痤瘡患病的相關性，但此相關性還需要進一步的研究來證實。研究方向從針對單獨一個菌種的研究向?qū)Χ鄠€菌種相互作用及人體皮膚微生態(tài)組成的研究的轉變，將會為治療痤瘡提供新的思路。