張秀娟，于海威，劉棟琦，趙晉彤，熊向華

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京 100071）

Sortase酶是一組存在于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中介導(dǎo)表面蛋白與細(xì)胞壁共價(jià)結(jié)合的蛋白酶，負(fù)責(zé)細(xì)胞表面蛋白的修飾和細(xì)菌鞭毛的構(gòu)建，在幫助病原細(xì)菌逃避宿主免疫系統(tǒng)方面起重要作用[1]。Sortase酶根據(jù)識(shí)別表面蛋白序列的不同可以分為A、B、C、D等多種，其中以在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)肽酶A（Sortase A，SrtA）研究得最為廣泛，其結(jié)構(gòu)、功能及催化機(jī)制均已闡明[2-3]。Sortase A酶具有一個(gè)典型的類(lèi)似Ⅱ型膜蛋白的N端跨膜區(qū)域和一個(gè)尾部富集正電荷的C端結(jié)構(gòu)域，可以特異性識(shí)別底物蛋白上的分選序列LPXTG（X為除半胱氨酸以外的任一氨基酸）[4-5]，在蘇氨酸（Thr）和甘氨酸（Gly）之間進(jìn)行剪切[6-7]，并將其與含有多甘氨酸接頭（GlyGlyGly-，G-）的底物蛋白進(jìn)行連接[8-9]。SrtA酶催化的連接反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、效率高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[10-11]，近年來(lái)已應(yīng)用于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、肽、核酸類(lèi)似物[12-13]、糖等活性物質(zhì)連接以及蛋白質(zhì)固定化[14-15]，展示出良好的應(yīng)用前景。但是野生型SrtA酶催化的連接反應(yīng)耗時(shí)長(zhǎng)、產(chǎn)率低，不同研究者開(kāi)展了包括提高催化活性、改變底物識(shí)別特征等一系列改造，Chen等報(bào)道P94S、D160N、D165A和K196T這4個(gè)位點(diǎn)的突變可將SrtA酶催化活性提高140多倍，推測(cè)突變型SrtA酶更利于底物進(jìn)入結(jié)合區(qū)域，從而大大提升連接效率[16-17]。

密碼子（codon）是中心法則的重要組成部分，同時(shí)也是生物遺傳和變異的最基本單元，對(duì)某物種基因組來(lái)說(shuō), 一些同義密碼子會(huì)頻繁出現(xiàn)，稱(chēng)為優(yōu)化密碼子；還有一些密碼子則很少出現(xiàn)甚至不出現(xiàn)，稱(chēng)為非優(yōu)化密碼子或稀有密碼子，這一現(xiàn)象稱(chēng)為密碼子偏好性（codon usage bias）[18-19]。不同物種之間對(duì)密碼子使用存在各自的偏好，各同義密碼子之間雖然不會(huì)改變氨基酸的序列，但對(duì)于蛋白的表達(dá)水平具有一定程度的影響[20-21]?；蚝铣墒且豁?xiàng)較為成熟的技術(shù)[22-23]，常與密碼子優(yōu)化配合使用[24-25]，本文選擇了高活性突變型的srtA酶基因，為解決SrtA酶在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)水平低、包涵體比例高的缺點(diǎn)，按照大腸桿菌偏好性進(jìn)行了密碼子優(yōu)化后合成了srtA基因并連入硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）共表達(dá)載體pTIG，導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)后通過(guò)低溫誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了SrtA酶的可溶性高表達(dá)，純化的SrtA酶成功實(shí)現(xiàn)了A型肉毒毒素（Botulinum toxins A，BoNT/A）活性缺失突變體LHN-LPETG結(jié)構(gòu)域和GHC結(jié)構(gòu)域的連接。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DH5α大腸桿菌感受態(tài)、BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài) 北京擎科生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒 北京達(dá)科為生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒 康為世紀(jì)生物科技有限公司；瓊脂糖 索萊寶科技有限公司；T4 DNA連接酶 NEB有限公司；IPTG 北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；pTIG-GHC、pTIG-LHNLPETG、PUC57-srtA質(zhì)粒（克隆載體） 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所。

Ni2+親和層析柱、強(qiáng)陰離子親和層析柱、強(qiáng)陽(yáng)離子親和層析柱 GE公司；3K-18型低溫冷凍離心機(jī) Sigma；T-1型PCR儀 Biometra；DYⅢ 3A型凝膠電泳儀 北京六一儀器廠；Gel-pro 2020D凝膠成 像 儀 pHarmacia Biotech；MiniPROTEAN?3 Cell蛋白電泳儀 Bio-RAD；AKTA UPC-900蛋白質(zhì)純化儀 GE；PAC200半干轉(zhuǎn)膜儀 Bio-Rad等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1srtA基因密碼子優(yōu)化 將高活性突變型srtA基因序列按大腸桿菌偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，交由北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 利用edit seq軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列如表1。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design

1.2.3 pTIG-srtA質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)優(yōu)化后的srtA基因序列設(shè)計(jì)正、反向引物，降落PCR擴(kuò)增目的基因片段后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠分離目的片段后回收。將目的片段與pTIG表達(dá)載體經(jīng)EcoRI+XhoI雙酶切后再次電泳驗(yàn)證并回收，二者于16℃連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，將菌液涂布于LB（Amp）固體培養(yǎng)基，倒置在37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽(yáng)性對(duì)照的PCR模板為PUC57-srtA，陰性對(duì)照的PCR模板為pTIG空載體。鑒定篩選后將陽(yáng)性克隆送至公司測(cè)序。

1.2.4 SrtA蛋白表達(dá)鑒定 將表達(dá)載體pTIG-srtA轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)，然后挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入終濃度0.5 mmol的IPTG置于16 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜。次日取1 mL菌液離心后重懸于500 μL TE裂解液，經(jīng)過(guò)超聲破碎后，取出20 μL備用（全菌），其余裂解液離心，吸取20 μL上清待用，去掉上清后沉淀部分用480 μL裂解液重懸，取20 μL備用（沉淀）。將全菌、上清、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，并利用Gelpro Analyzer軟件分析蛋白表達(dá)量。

1.2.5 SrtA蛋白純化 取pTIG-srtA/BL21（DE3）單菌落至搖瓶培養(yǎng)，按1.2.4低溫誘導(dǎo)表達(dá)，超聲裂解后利用AKTA純化儀梯度洗脫純化蛋白。經(jīng)前期純化條件摸索，srtA蛋白需經(jīng)過(guò)兩步純化，第一步使用強(qiáng)陽(yáng)離子柱進(jìn)行純化，收集洗脫液后液通過(guò)3 kDa截留分子量的超濾管進(jìn)行超濾換液脫鹽，將溶液置換為Ni2+柱平衡液。第二步通過(guò)Ni2+親和層析柱進(jìn)行二次純化，純化后采用3 kDa截留分子量的超濾管進(jìn)行超濾換液脫鹽濃縮，利用SDS-PAGE及Gelpro Analyzer軟件分析純化蛋白純度，同時(shí)使用抗His標(biāo)簽抗體為一抗進(jìn)行Western Blot鑒定。純化體系平衡液、洗脫液見(jiàn)表2。

表2 純化平衡液、洗脫液Table 2 loading buffer and elution buffer

1.2.6 SrtA蛋白活性鑒定 分別將pTIG-G-HC、pTIG-LHN-LPETG質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，按照1.2.4及1.2.5進(jìn)行表達(dá)鑒定及純化，G-HC純化步驟同SrtA純化。LHN-LPETG蛋白需經(jīng)過(guò)兩步純化，第一步進(jìn)行Ni2+親和層析柱純化，利用30 kDa截留分子量的超濾管對(duì)收集的洗脫液進(jìn)行超濾換液，將溶液置換為強(qiáng)陰離子柱平衡液，第二步利用強(qiáng)陰離子柱進(jìn)行純化，純化后兩種蛋白利用抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行WesternBlot鑒定。

將純化后的SrtA、G-HC、LHN-LPETG蛋白按照摩爾比1:1:1混合后分裝于EP管中，每支20 μL，分別置于37和30 ℃孵育0.5、1、2、4 h進(jìn)行蛋白連接。孵育完成后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定及Western Blot鑒定，Western Blot所用一抗為特異性針對(duì)GHC的抗體，二抗為山羊抗人IgG抗體。

1.2.7 分子篩純化BoNT/A失活突變體 利用SuperdexG200分子篩（平衡液為20 mmol/L PBS、150 mmol/L NaCl）純化連接體系中的BoNT/A失活突變體，少量多次收取穿過(guò)液，待完全收集穿過(guò)液后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用DNAMAN軟件比對(duì)分析陽(yáng)性克隆序列是否正確；使用Gelpro Analyzer軟件分析純化蛋白純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 pTIG-srtA質(zhì)粒構(gòu)建

高活性突變型srtA基因序列按大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，并送公司進(jìn)行全基因合成。PCR擴(kuò)增后經(jīng)EcoRI+XhoI雙酶切連入pTIG質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，結(jié)果如圖1所示，PCR擴(kuò)增片段大小與srtA基因大小相符。陽(yáng)性克隆測(cè)定序列經(jīng)DNAMAN軟件比對(duì)，結(jié)果顯示與預(yù)期序列一致，表明成功構(gòu)建pTIG-srtA基因表達(dá)載體。

2.2 SrtA蛋白表達(dá)

圖1 pTIG-SrtA/DH5α菌落PCR鑒定Fig.1 Colony PCR identification of recombinant plasmid pTIG-SrtA

將表達(dá)載體pTIG-srtA基因轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)，挑單菌落至LB（Amp）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，加入IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜，收集菌體經(jīng)超聲裂解后進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖2所示，與陰性對(duì)照相比，1～5泳道都有特異性蛋白表達(dá)條帶，分子量為20 kDa左右，與SrtA蛋白大小相符；而且目的蛋白大部分在菌體裂解上清部分，說(shuō)明SrtA蛋白主要為可溶性表達(dá)。Gelpro Analyzer軟件分析SrtA蛋白表達(dá)量占全菌蛋白55%。

圖2 SrtA蛋白表達(dá)的SDS-PAGE鑒定Fig.2 SDS-PAGE identification ofSrtA protein expression

2.3 SrtA蛋白純化

挑取新鮮pTIG-srtA/BL21（DE3）單菌落至LB（Amp）液體培養(yǎng)基培養(yǎng)活化，轉(zhuǎn)接至LB（Amp）液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入IPTG置于16 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜。離心收集菌體并超聲裂解，第一步使用強(qiáng)陽(yáng)離子柱進(jìn)行純化，收集洗脫液后液通過(guò) 3 kDa截留分子量的超濾管進(jìn)行超濾換液，將溶液置換為Ni2+柱平衡液。第二步通過(guò)Ni2+親和層析柱進(jìn)行二次純化，收集洗脫液20%～40%部分的洗脫峰（圖3）進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，各泳道為分段接取的洗脫液，于20 kDa附近可見(jiàn)清晰條帶。采用3 kDa截留分子量的超濾管進(jìn)行超濾換液脫鹽，經(jīng)SDS-PAGE分析純化蛋白純度，Gelpro Analyzer軟件分析純化的結(jié)果表明SrtA蛋白純度＞95%（圖4）。Western Blot分析表明純化的SrtA蛋白能特異性地與抗His標(biāo)簽抗體結(jié)合（圖5）。

圖3 Ni2+親和層析純化SrtA蛋白SDS-PAGE鑒定（20%～40%部分洗脫液）Fig.3 SDS-PAGE identification of SrtA protein purified by Ni2+ affinity chromatography column（20%～40% elution buffer）注：M：蛋白分子質(zhì)量相對(duì)標(biāo)志物；其余泳道為分段接取的純化洗脫液。

2.4 SrtA蛋白活性鑒定

將表達(dá)載體pTIG-G-HC、pTIG-LHN-LPETG分別轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)中進(jìn)行表達(dá)，利用SDSPAGE鑒定蛋白表達(dá)方式，Gelpro Analyzer軟件分析蛋白表達(dá)量。如圖6（a）所示，各泳道為分段接取的洗脫液，在50 kDa 附近有清晰條帶，分子量大小與G-HC蛋白相符，表達(dá)量占全菌蛋白40%，且主要為可溶性表達(dá)。如圖6（b）所示，各泳道為分段接取的洗脫液，在100 kDa附近有特異表達(dá)條帶，分子量大小與LHN-LPETG蛋白相符，表達(dá)量占全菌蛋白25%，且主要為可溶性表達(dá)。

圖4 SrtA蛋白超濾換液后SDS-PAGE鑒定Fig.4 SDS-PAGE identification of SrtA protein after ultrafiltrate

圖5 Western Blot鑒定G-HC、LHN-LPETG、SrtA蛋白Fig.5 Western Blot identification protein of G-HC,LHN-LPETG, SrtA

SDS-PAGE鑒定結(jié)果表明，G-HC及LHN-LPETG表達(dá)蛋白經(jīng)純化后得到較高純度目的蛋白（圖7）；Western Blot分析表明純化的G-HC及LHN-LPETG蛋白蛋白能特異性地與抗His標(biāo)簽抗體結(jié)合（圖5）。

圖6 G-HC、LHN-LPETG表達(dá)形式SDS-PAGE鑒定Fig.6 SDS-PAGE identification of G-HC、LHN-LPETG expression

圖7 Ni2+親和層析柱純化后的G-HC、LHN-LPETG蛋白SDS-PAGE鑒定Fig.7 SDS-PAGE identification ofprotein purified by Ni2+ affinity chromatography column

圖8 SDS-PAGE鑒定不同孵育時(shí)間下連接生成的BoNT/A失活突變體Fig.8 SDS-PAGE identification of inactivated BoNT/A generated by connection at different incubation times

將純化后的SrtA、G-HC、LHN-LPETG蛋白按照摩爾比1:1:1混合后分裝于EP管中，于37和30 ℃連接0.5、1、2、4 h，結(jié)果如圖8所示。隨著連接時(shí)間的增加，在150 kDa附近逐漸出現(xiàn)條帶，大小與BoNT/A失活突變體全長(zhǎng)蛋白相符。如圖9所示，Western Blot鑒定結(jié)果表明，連接蛋白可以與抗GHc抗體結(jié)合，進(jìn)一步表明150 kDa處連接蛋白為BoNT/A失活突變體全長(zhǎng)蛋白。

圖9 Western Blot鑒定連接生成的BoNT/A失活突變體Fig.9 Western Blot identification of mutant of BoNT/A generated by connection

連接體系經(jīng)分子篩純化后收集目的蛋白洗脫峰，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在150 kDa附近有可見(jiàn)條帶，表明純化得到全長(zhǎng)BoNT/A活性突變體蛋白（圖10）。

圖10 SDS-PAGE鑒定SuperdexG200分子篩純化的BoNT/A失活突變體Fig.10 SDS-PAGE identification of purified mutant of BoNT/A by Superdex G200 molecular sieve

3 結(jié)論

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是一種應(yīng)用廣泛的蛋白制備技術(shù)，其具有操作難度低、成本低廉、 制備周期短等優(yōu)點(diǎn)[26-27]，實(shí)驗(yàn)室前期嘗試在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)未經(jīng)密碼子優(yōu)化的srtA基因，但與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，原始SrtA蛋白表達(dá)水平低而且主要為包涵體[11]，后續(xù)純化難度較大且需要復(fù)性[28],其原因可能是在原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，由于蛋白合成速度過(guò)快，導(dǎo)致目的蛋白存在來(lái)不及正確折疊及組裝的情況，會(huì)形成無(wú)生物活性的蛋白聚集物即包涵體[29-30]。本研究將srtA基因按大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并克隆入pTIG表達(dá)載體與硫氧還蛋白（Trx）進(jìn)行共表達(dá)，結(jié)果表明在大腸桿菌BL21（DE3）中經(jīng)16℃低溫誘導(dǎo)過(guò)夜實(shí)現(xiàn)了SrtA蛋白的可溶性高表達(dá)，表達(dá)量占全菌蛋白的50%以上。進(jìn)一步親和層析純化得到了純度＞95%的SrtA蛋白。純化的SrtA蛋白能夠完成帶有特征識(shí)別序列的BoNT/A失活突變體的兩部分片段LHN-LPETG和G-HC的酶法連接，得到全長(zhǎng)的BoNT/A失活突變體蛋白，這充分說(shuō)明在大腸桿菌中表達(dá)純化的SrtA蛋白具有轉(zhuǎn)肽酶活性。