宋 川，王利娟，汪玲玲,

（1.廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)學(xué)院，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642；2.農(nóng)業(yè)部人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)和技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1-2]。該類(lèi)分子主要是由一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)M成，包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2等幾十種類(lèi)型，其中毒性最強(qiáng)、危害最大的是AFB1。農(nóng)作物從收獲、儲(chǔ)藏到運(yùn)輸加工的各個(gè)過(guò)程中均可能受到產(chǎn)毒真菌的污染，其產(chǎn)生的AFB1通過(guò)食物鏈的傳遞，嚴(yán)重威脅人類(lèi)和動(dòng)物的生命健康。因此，目前迫切需要尋找到行之有效的解毒措施挽救因霉變帶來(lái)的巨額經(jīng)濟(jì)損失并解決公眾擔(dān)憂(yōu)的健康問(wèn)題。

AFB1的脫毒方法主要包括物理、化學(xué)和生物法。物理脫毒法通常采用烹煮、吸附、紫外線(xiàn)照射等方式[3]。其中工業(yè)中應(yīng)用最多的是在飼料中添加吸附劑來(lái)達(dá)到脫毒的目的，一些常見(jiàn)的吸附劑有水合鈉鋁硅酸鈣、粘土、蒙脫石、活性炭等?；瘜W(xué)脫毒法是利用化學(xué)反應(yīng)改變黃曲霉毒素的分子結(jié)構(gòu)，從而降低其細(xì)胞毒性的方法。常見(jiàn)的方法包括氨水堿處理法[4]、檸檬酸酸化法[5]，還有文獻(xiàn)報(bào)道了使用乳酸、臭氧、過(guò)氧化氫、中性電解氧化水等方法脫毒[6-7]。由于化學(xué)試劑的使用會(huì)在一直程度上對(duì)人和動(dòng)物的健康造成損害，因此目前在工業(yè)中沒(méi)有被廣泛使用。生物法是采用微生物或者植物提取物對(duì)AFB1進(jìn)行吸附或者降解從而實(shí)現(xiàn)脫毒目的。利用微生物及其產(chǎn)生的酶進(jìn)行生物脫毒，有作用時(shí)間短、反應(yīng)條件溫和、專(zhuān)一性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，是目前公認(rèn)最為理想的脫毒方法。但仍然存在著代謝機(jī)理不清晰、脫毒功能不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，此外在應(yīng)用過(guò)程中必須綜合考慮降解產(chǎn)物的安全性、微生物的脫毒效率以及對(duì)食品中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響等問(wèn)題，最終建立一個(gè)經(jīng)濟(jì)高效的微生物脫毒技術(shù)。

本文系統(tǒng)介紹了AFB1的生物合成途徑、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)及其發(fā)揮細(xì)胞毒性的分子基團(tuán)；著重總結(jié)了目前已報(bào)道的可降解AFB1的微生物種類(lèi)、已分離到的關(guān)鍵酶和已經(jīng)研究清楚的微生物代謝途徑；最后簡(jiǎn)要介紹了微生物在食品脫毒方面的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。希望為通過(guò)微生物降解AFB1的研究者們提供一些指導(dǎo)，從而提高食品安全。

1 AFB1的形成過(guò)程、結(jié)構(gòu)特征及其分子毒性基團(tuán)

1.1 形成過(guò)程

目前，參與黃曲霉毒素生物合成的一系列基因、酶及調(diào)控因子已經(jīng)基本清楚。如圖1所示，AFB1的生物合成途徑是：乙酰輔酶A→諾素羅瑞尼克酸（NOR）→奧佛蘭提素（AVN）→奧佛蘭凡素（HAVN）→奧佛尼紅素（AVF）→羥基雜色酮（HVN）→雜色半縮醛乙酸（NHA）→雜色曲霉B（VERB）→雜色曲霉A（VERA）→柄曲霉素（DMST）→雜色曲霉素（ST）→黃曲霉毒素B1（AFB1）[8-9]。宮等分離的阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）Vt-7通過(guò)產(chǎn)生揮發(fā)物質(zhì)1-戊醇和苯乙醇，下調(diào)黃曲霉中norB基因表達(dá)量，從而抑制諾素羅瑞尼克酸轉(zhuǎn)化成奧佛蘭提素，繼而抑制黃曲霉毒素的合成[10]；Chen等發(fā)現(xiàn)的一株海洋巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）產(chǎn)生的三種肽可抑制黃曲霉菌生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和黃曲霉毒素產(chǎn)生。起關(guān)鍵抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的fadA-pkaA信號(hào)通路被激活，其相關(guān)基因均上調(diào)，而控制合成黃曲霉毒素的基因aflR和aflS明顯下調(diào)，黃曲霉毒素產(chǎn)生收到抑制[11]。

1.2 結(jié)構(gòu)性質(zhì)

黃曲霉毒素屬于二氫呋喃氧萘鄰?fù)难苌?。根?jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，黃曲霉毒素可以分為兩類(lèi)，一類(lèi)結(jié)構(gòu)包含二呋喃、香豆素、環(huán)戊烯酮，如圖2A所示，有 AFB1、AFB2、AFM1、AFM2、AFB2a、AFQ1等。AFB1和AFM1是被食品工業(yè)所重點(diǎn)關(guān)注的，AFM1是AFB1的羥基化衍生物，在牛奶中常常被檢出[12]；另一類(lèi)結(jié)構(gòu)包含二呋喃、香豆素、二氫吡喃，如圖2B所示，有AFG1、AFG2、AFG2a等[13]。黃曲霉毒素相對(duì)分子量為312～346，難溶于水，易溶于氯仿、甲醇等，不溶于石油醚、己烷。具有耐熱性，AFB1在268～269 ℃下才開(kāi)始分解[14]。在紫外線(xiàn)的照射下會(huì)發(fā)出熒光，其在中性條件下較穩(wěn)定，在強(qiáng)酸性溶液中會(huì)有極少量的分解，在堿性溶液中較易分解。

圖1 黃曲霉毒素B1的生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway of AFB1

圖2 黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)Fig.2 The structure of aflatoxins

1.3 毒性基團(tuán)

研究表明長(zhǎng)期接觸黃曲霉毒素會(huì)導(dǎo)致中毒性肝炎、肝細(xì)胞壞死、免疫抑制和肝癌的發(fā)生[15-16]。常見(jiàn)黃曲霉毒素的類(lèi)型中毒性大小順序依次是AFB1＞AFM1＞AFG1＞AFB2＞AFM2＞AFG2，其中AFB1早在2002年被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為一級(jí)致癌物[17]。AFB1在人和動(dòng)物體內(nèi)被代謝轉(zhuǎn)化成AFB1-8，9-環(huán)氧化物，AFB1-8，9-環(huán)氧化物會(huì)攻擊DNA堿基鳥(niǎo)嘌呤的N7位點(diǎn)，生成AFB1-N7-Gua，導(dǎo)致DNA損傷[18-19]。AFB1化學(xué)結(jié)構(gòu)中主要有三個(gè)毒性基團(tuán)，如圖3所示。第一個(gè)毒性基團(tuán)是呋喃環(huán)上的8、9位雙鍵，蛋白質(zhì)和核酸會(huì)在此位點(diǎn)上與AFB1發(fā)生相互作用；第二個(gè)毒性基團(tuán)是香豆素的內(nèi)酯環(huán)部分中的10、11、15號(hào)位點(diǎn)；第三個(gè)基團(tuán)是AFB1位于環(huán)戊烯酮環(huán)上的1、2、3、14號(hào)位點(diǎn)，該基團(tuán)也對(duì)AFB1的毒性有一定的影響。

圖3 AFB1主要的毒性基團(tuán)Fig.3 Main toxic group of AFB1

2 代謝AFB1的微生物

2.1 細(xì)菌

關(guān)于細(xì)菌降解黃曲霉毒素的報(bào)道可以追溯到上世紀(jì)70年代。目前已從土壤、水、動(dòng)物糞便和腸道等各種環(huán)境中成功分離到幾十種AFB1代謝菌株。AFB1代謝菌主要來(lái)自變形桿菌門(mén)、放線(xiàn)桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)。厚壁菌門(mén)中主要是芽孢桿菌屬[20-25]；變形桿菌門(mén)中有假單胞菌屬[26-27]、粘球菌屬[28]、寡氧單胞菌屬[29]、腸桿菌屬、克雷伯菌屬、埃希氏菌屬[30]等屬的菌株；放線(xiàn)桿菌門(mén)中有紅球菌屬[29,31]、諾卡氏菌屬[31]、分支桿菌屬[32]、棒狀桿菌屬[33]、短桿菌屬、鏈霉菌屬等屬的菌株；擬桿菌門(mén)中主要有黃桿菌屬等[34-35]，其中部分菌株的代謝情況如表1所示。

2.2 真菌

目前報(bào)道的可以降解AFB1的真菌，主要來(lái)自擔(dān)子菌門(mén)、接合菌門(mén)、子囊菌門(mén)和半知菌亞門(mén)。其中，屬于擔(dān)子菌門(mén)的有假蜜環(huán)菌屬[40-41]、側(cè)耳菌屬[42-43]等；子囊菌門(mén)中有酵母菌屬[44]、曲霉屬[45-46]等；接合菌門(mén)中有毛霉屬[47]、根霉屬[48-49]等；半知菌亞門(mén)中有木霉菌屬[50]，其中部分菌株的代謝情況如表2所示。

3 微生物中參與AFB1代謝的關(guān)鍵酶

目前已知真菌的降解酶大部分是屬于氧化還原酶類(lèi)，有漆酶、過(guò)氧化物酶等。最初Liu等發(fā)現(xiàn)假蜜環(huán)菌（Armillariella tabescens）可以參與AFB1的生物轉(zhuǎn)化[40]，隨后Cao從該假蜜環(huán)菌中分離純化出黃曲霉毒素氧化酶（AFO）[54]；Yehia等采用了硫酸銨、DEAE-瓊脂糖凝膠柱、G-100瓊脂糖凝膠柱從平菇（Pleurotus ostreatus）中提取了錳過(guò)氧化物酶（MnP），最終酶的活力達(dá)到了81 U/mL，最適溫度在25 ℃，最適pH在4～5之間[55]；Alberts在不同的液體培養(yǎng)基中研究了白腐真菌通過(guò)產(chǎn)生漆酶對(duì)黃曲霉毒素的降解[56]，Loi從肺形杏鮑菇（Pleurotus pulmonarius）中分離出漆酶2，并證明了乙酰丁香酮（AS）等三種天然化合物可以增強(qiáng)該酶的降解效果[57]。

在細(xì)菌中分離得到的降解酶相對(duì)較少。多數(shù)研究結(jié)果表明降解AFB1的活性物質(zhì)分布在發(fā)酵液的上清中。Zhao從橙色粘球菌（Myxococcus fulvus）ANSM068中分離提純了一種胞外酶，命名為MADE，具有降解AFB1、AFG1、AFM1的能力[28]；Xie等從泛菌（Pantoea sp）T6的發(fā)酵上清液中，分離純化出一種可以降解AFB1的酶，命名為PADE[39]；Song等從銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）M19上清液中采用硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析分離純化了一種酶，也命名為PADE。已報(bào)道的AFB1代謝酶如表3所示。

表1 降解黃曲霉毒素B1的細(xì)菌Table 1 Bacterium for degrading aflatoxin B1

表2 降解黃曲霉毒素B1的真菌Table 2 Fungi for degrading aflatoxin B1

關(guān)于微生物參與代謝AFB1關(guān)鍵基因的報(bào)道較少。在芽孢菌中，有的可能攜帶aiiA基因，它編碼N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶（AHL），該酶具有裂解內(nèi)酯環(huán)酯鍵的能力，因此Pereyra假設(shè)如果它們可以裂解AFB1，則是負(fù)責(zé)降解毒素的內(nèi)酯部分[59]。Afsharmanesh分析了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）UTB1的全基因組，通過(guò)比對(duì)和基因敲除等實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中的bacC基因能夠抑制黃曲霉合成黃曲霉毒素，同時(shí)也能夠降解黃曲霉毒素[60]。

4 微生物中已知的AFB1代謝途徑

微生物中最早報(bào)道的AFB1代謝途徑是作用在8,9-不飽和碳碳雙鍵上的氧化反應(yīng)，如圖4A所示。劉大嶺團(tuán)隊(duì)從假蜜環(huán)菌中分離純化出的AFO作用在AFB1的8,9-不飽和碳碳雙鍵上，首先形成AFB1-8,9-環(huán)氧化物，后又被轉(zhuǎn)化為AFB1-9-羥基二烯丙基二酚[61-62]。AFO的作用是氧依賴(lài)性，并且可以產(chǎn)生過(guò)氧化氫。后續(xù)對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行毒性試驗(yàn)，結(jié)果顯示代謝物在小鼠的肝臟里沒(méi)有毒性作用，對(duì)于鼠傷寒沙門(mén)氏菌沒(méi)有致突變性，在雞中也沒(méi)有遺傳毒性[41]；Wang從白腐真菌（Phanerochaete sordida）YK-624中提取錳過(guò)氧化物酶處理AFB1，質(zhì)子核磁共振和高分辨率的電離子質(zhì)譜技術(shù)分析表明，AFB1首先被MnP氧化為AFB1-8,9-環(huán)氧化物，然后水解為AFB1-8,9-二氫二醇[63]。

表3 黃曲霉毒素B1降解酶Table 3 Purified enzymes identified as AFB1degraders

圖4 AFB1的代謝途徑Fig.4 Metabolic pathway of AFB1

Samuel等報(bào)道了一株惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida）能夠高效降解AFB1，代謝產(chǎn)物采取硅膠柱純化后通過(guò)紅外光譜和氣相質(zhì)譜確定其結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示代謝是從內(nèi)酯環(huán)的酯鍵水解開(kāi)環(huán)開(kāi)始的，脫羧形成代謝物AFD1，另外還可以形成AFD2[26]。其代謝途徑如圖4B所示。Eshelli分離得到的紅球菌（Rhodococcus erythropolis）ATCC 4277能夠降解AFB1，經(jīng)質(zhì)譜等分析代謝產(chǎn)物，推測(cè)AFD1可能是代謝途徑中的一個(gè)中間產(chǎn)物[38]。

一些真菌可以可以通過(guò)與AFB1的環(huán)戊烯酮環(huán)作用，將AFB1轉(zhuǎn)化成黃曲霉毒醇（AFL），其代謝途徑如圖4C所示。例如匍匐梨頭霉（Absidia repens）、樹(shù)狀指孢霉（Dactylium dendroides）、灰藍(lán)毛霉（Mucor griseo-cyanus）、根腐長(zhǎng)孺孢（Helminthosporium sativum）[2]、木霉（Trichoderma）[49]、黑曲霉（Aspergillus niger）、黃曲霉、蠟葉散囊菌（Eurotium herbariorum）以及根霉（Rhizopus）等，其中黑曲霉又可以將AFL轉(zhuǎn)化成AFB1[2]。

Taylor等報(bào)道了一株恥垢分枝桿菌產(chǎn)生的依賴(lài)于脫氮黃素輔助因子（F420H2）的還原酶FDR-A和FDR-B，可以還原位于黃曲霉素B1和G1上內(nèi)酯環(huán)與環(huán)戊烯酮環(huán)之間的α，β-不飽和酯上的雙鍵，得到加氫的產(chǎn)物[64]。它的代謝途徑如圖4D所示。

5 微生物代謝AFB1的應(yīng)用基礎(chǔ)研究

利用微生物或酶分解代謝AFB1的原理，可在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中添加活性菌或者酶制劑，以緩解飼料中AFB1給飼喂動(dòng)物帶來(lái)的毒害。趙麗紅等發(fā)現(xiàn)AFB1降解菌枯草芽孢桿菌ANSB060可以在一定程度上改善黃曲霉毒素對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的不利影響[65]；范彧用肉雞實(shí)驗(yàn)證實(shí)在受黃曲霉毒素污染的花生粕中添加該菌可以抵消AFB1引起雞的氧化損傷，抑制其對(duì)肝功能的毒害作用[66-67]；另外，范彧也證實(shí)了在AFB1污染的鯉魚(yú)飼料中添加此菌株，能夠有效恢復(fù)鯉魚(yú)的體重，改善肝臟、胰腺等功能[68]。

趙楊等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌N-1a在玉米青貯試驗(yàn)中能夠明顯降低青貯過(guò)程中的黃曲霉毒素含量，并且判斷活性物質(zhì)是一種分泌蛋白[69]；從開(kāi)心果中篩選的枯草芽孢桿菌UTBSP1可以降低開(kāi)心果中的AFB1[70]；曹紅等基于來(lái)自假蜜環(huán)菌的黃曲霉毒素氧化酶，制成酶制劑，發(fā)現(xiàn)其能夠有效減緩AFB1對(duì)肉仔雞肝臟的損害，從而提高肉仔雞的平均日采食量，增加重量[71]。

6 目前研究中遇到的問(wèn)題和挑戰(zhàn)

黃曲霉毒素廣泛存在于食品中，對(duì)人類(lèi)的健康構(gòu)成了巨大的威脅。微生物種類(lèi)多，繁殖快，是最為理想的脫毒生物類(lèi)群。從微生物中篩選高效降解菌并研究其分解代謝機(jī)制一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前已經(jīng)分離到了包括放線(xiàn)菌、細(xì)菌、真菌在內(nèi)的超過(guò)幾十種微生物都可以分解代謝黃曲霉毒素，但研究過(guò)程中仍遇到不少問(wèn)題和挑戰(zhàn)。首先，微生物中黃曲霉毒素的代謝途徑認(rèn)識(shí)不足。目前僅有少數(shù)菌株明確了代謝途徑。對(duì)于大部分菌株來(lái)說(shuō)，AFB1是通過(guò)哪些反應(yīng)形成產(chǎn)物的并不清楚。其次，微生物中發(fā)揮AFB1降解活性的物質(zhì)不清楚。已有的文獻(xiàn)表明一些菌株可以產(chǎn)生對(duì)蛋白酶敏感、熱力條件下穩(wěn)定的活性物質(zhì)，推測(cè)是耐熱酶，但是無(wú)法成功分離該物質(zhì)[24,26,29-30]。這些活性物質(zhì)是不是酶，是哪種酶仍然不能確定。此外，由于多數(shù)菌株的解毒基因沒(méi)有成功克隆，其代謝調(diào)控機(jī)制也無(wú)從了解。由此可見(jiàn)，盡管明確了多種微生物能降解黃曲霉毒素的現(xiàn)象，但是對(duì)于其內(nèi)在的代謝機(jī)制問(wèn)題的認(rèn)識(shí)還十分欠缺，阻礙了降解微生物的實(shí)際應(yīng)用。將來(lái)還要在化合物結(jié)構(gòu)鑒定、酶的分離與純化以及功能基因分析等幾個(gè)方面加強(qiáng)研究，只有在分子機(jī)制研究上有所突破，才能真正推進(jìn)微生物脫毒菌劑走向市場(chǎng)。