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        微生物代謝黃曲霉毒素B1的研究進展

        2021-06-18 01:01:48王利娟汪玲玲
        食品工業(yè)科技 2021年10期
        關(guān)鍵詞:黃曲霉基團毒素

        宋 川,王利娟,汪玲玲,

        (1.廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點實驗室,生命科學(xué)學(xué)院,華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東廣州 510642;2.農(nóng)業(yè)部人畜共患病重點實驗室,華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東廣州 510642;3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)和技術(shù)廣東省實驗室,華南農(nóng)業(yè)大學(xué),廣東廣州 510642;4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東廣州 510642)

        黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是由黃曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1-2]。該類分子主要是由一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰?fù)M成,包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2等幾十種類型,其中毒性最強、危害最大的是AFB1。農(nóng)作物從收獲、儲藏到運輸加工的各個過程中均可能受到產(chǎn)毒真菌的污染,其產(chǎn)生的AFB1通過食物鏈的傳遞,嚴重威脅人類和動物的生命健康。因此,目前迫切需要尋找到行之有效的解毒措施挽救因霉變帶來的巨額經(jīng)濟損失并解決公眾擔(dān)憂的健康問題。

        AFB1的脫毒方法主要包括物理、化學(xué)和生物法。物理脫毒法通常采用烹煮、吸附、紫外線照射等方式[3]。其中工業(yè)中應(yīng)用最多的是在飼料中添加吸附劑來達到脫毒的目的,一些常見的吸附劑有水合鈉鋁硅酸鈣、粘土、蒙脫石、活性炭等?;瘜W(xué)脫毒法是利用化學(xué)反應(yīng)改變黃曲霉毒素的分子結(jié)構(gòu),從而降低其細胞毒性的方法。常見的方法包括氨水堿處理法[4]、檸檬酸酸化法[5],還有文獻報道了使用乳酸、臭氧、過氧化氫、中性電解氧化水等方法脫毒[6-7]。由于化學(xué)試劑的使用會在一直程度上對人和動物的健康造成損害,因此目前在工業(yè)中沒有被廣泛使用。生物法是采用微生物或者植物提取物對AFB1進行吸附或者降解從而實現(xiàn)脫毒目的。利用微生物及其產(chǎn)生的酶進行生物脫毒,有作用時間短、反應(yīng)條件溫和、專一性強等諸多優(yōu)點,是目前公認最為理想的脫毒方法。但仍然存在著代謝機理不清晰、脫毒功能不穩(wěn)定等缺點,此外在應(yīng)用過程中必須綜合考慮降解產(chǎn)物的安全性、微生物的脫毒效率以及對食品中營養(yǎng)物質(zhì)的影響等問題,最終建立一個經(jīng)濟高效的微生物脫毒技術(shù)。

        本文系統(tǒng)介紹了AFB1的生物合成途徑、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)及其發(fā)揮細胞毒性的分子基團;著重總結(jié)了目前已報道的可降解AFB1的微生物種類、已分離到的關(guān)鍵酶和已經(jīng)研究清楚的微生物代謝途徑;最后簡要介紹了微生物在食品脫毒方面的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。希望為通過微生物降解AFB1的研究者們提供一些指導(dǎo),從而提高食品安全。

        1 AFB1的形成過程、結(jié)構(gòu)特征及其分子毒性基團

        1.1 形成過程

        目前,參與黃曲霉毒素生物合成的一系列基因、酶及調(diào)控因子已經(jīng)基本清楚。如圖1所示,AFB1的生物合成途徑是:乙酰輔酶A→諾素羅瑞尼克酸(NOR)→奧佛蘭提素(AVN)→奧佛蘭凡素(HAVN)→奧佛尼紅素(AVF)→羥基雜色酮(HVN)→雜色半縮醛乙酸(NHA)→雜色曲霉B(VERB)→雜色曲霉A(VERA)→柄曲霉素(DMST)→雜色曲霉素(ST)→黃曲霉毒素B1(AFB1)[8-9]。宮等分離的阿氏腸桿菌(Enterobacter asburiae)Vt-7通過產(chǎn)生揮發(fā)物質(zhì)1-戊醇和苯乙醇,下調(diào)黃曲霉中norB基因表達量,從而抑制諾素羅瑞尼克酸轉(zhuǎn)化成奧佛蘭提素,繼而抑制黃曲霉毒素的合成[10];Chen等發(fā)現(xiàn)的一株海洋巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)產(chǎn)生的三種肽可抑制黃曲霉菌生長、孢子萌發(fā)和黃曲霉毒素產(chǎn)生。起關(guān)鍵抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的fadA-pkaA信號通路被激活,其相關(guān)基因均上調(diào),而控制合成黃曲霉毒素的基因aflR和aflS明顯下調(diào),黃曲霉毒素產(chǎn)生收到抑制[11]。

        1.2 結(jié)構(gòu)性質(zhì)

        黃曲霉毒素屬于二氫呋喃氧萘鄰?fù)难苌?。根?jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同,黃曲霉毒素可以分為兩類,一類結(jié)構(gòu)包含二呋喃、香豆素、環(huán)戊烯酮,如圖2A所示,有 AFB1、AFB2、AFM1、AFM2、AFB2a、AFQ1等。AFB1和AFM1是被食品工業(yè)所重點關(guān)注的,AFM1是AFB1的羥基化衍生物,在牛奶中常常被檢出[12];另一類結(jié)構(gòu)包含二呋喃、香豆素、二氫吡喃,如圖2B所示,有AFG1、AFG2、AFG2a等[13]。黃曲霉毒素相對分子量為312~346,難溶于水,易溶于氯仿、甲醇等,不溶于石油醚、己烷。具有耐熱性,AFB1在268~269 ℃下才開始分解[14]。在紫外線的照射下會發(fā)出熒光,其在中性條件下較穩(wěn)定,在強酸性溶液中會有極少量的分解,在堿性溶液中較易分解。

        圖1 黃曲霉毒素B1的生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway of AFB1

        圖2 黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)Fig.2 The structure of aflatoxins

        1.3 毒性基團

        研究表明長期接觸黃曲霉毒素會導(dǎo)致中毒性肝炎、肝細胞壞死、免疫抑制和肝癌的發(fā)生[15-16]。常見黃曲霉毒素的類型中毒性大小順序依次是AFB1>AFM1>AFG1>AFB2>AFM2>AFG2,其中AFB1早在2002年被國際癌癥研究機構(gòu)認定為一級致癌物[17]。AFB1在人和動物體內(nèi)被代謝轉(zhuǎn)化成AFB1-8,9-環(huán)氧化物,AFB1-8,9-環(huán)氧化物會攻擊DNA堿基鳥嘌呤的N7位點,生成AFB1-N7-Gua,導(dǎo)致DNA損傷[18-19]。AFB1化學(xué)結(jié)構(gòu)中主要有三個毒性基團,如圖3所示。第一個毒性基團是呋喃環(huán)上的8、9位雙鍵,蛋白質(zhì)和核酸會在此位點上與AFB1發(fā)生相互作用;第二個毒性基團是香豆素的內(nèi)酯環(huán)部分中的10、11、15號位點;第三個基團是AFB1位于環(huán)戊烯酮環(huán)上的1、2、3、14號位點,該基團也對AFB1的毒性有一定的影響。

        圖3 AFB1主要的毒性基團Fig.3 Main toxic group of AFB1

        2 代謝AFB1的微生物

        2.1 細菌

        關(guān)于細菌降解黃曲霉毒素的報道可以追溯到上世紀70年代。目前已從土壤、水、動物糞便和腸道等各種環(huán)境中成功分離到幾十種AFB1代謝菌株。AFB1代謝菌主要來自變形桿菌門、放線桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門。厚壁菌門中主要是芽孢桿菌屬[20-25];變形桿菌門中有假單胞菌屬[26-27]、粘球菌屬[28]、寡氧單胞菌屬[29]、腸桿菌屬、克雷伯菌屬、埃希氏菌屬[30]等屬的菌株;放線桿菌門中有紅球菌屬[29,31]、諾卡氏菌屬[31]、分支桿菌屬[32]、棒狀桿菌屬[33]、短桿菌屬、鏈霉菌屬等屬的菌株;擬桿菌門中主要有黃桿菌屬等[34-35],其中部分菌株的代謝情況如表1所示。

        2.2 真菌

        目前報道的可以降解AFB1的真菌,主要來自擔(dān)子菌門、接合菌門、子囊菌門和半知菌亞門。其中,屬于擔(dān)子菌門的有假蜜環(huán)菌屬[40-41]、側(cè)耳菌屬[42-43]等;子囊菌門中有酵母菌屬[44]、曲霉屬[45-46]等;接合菌門中有毛霉屬[47]、根霉屬[48-49]等;半知菌亞門中有木霉菌屬[50],其中部分菌株的代謝情況如表2所示。

        3 微生物中參與AFB1代謝的關(guān)鍵酶

        目前已知真菌的降解酶大部分是屬于氧化還原酶類,有漆酶、過氧化物酶等。最初Liu等發(fā)現(xiàn)假蜜環(huán)菌(Armillariella tabescens)可以參與AFB1的生物轉(zhuǎn)化[40],隨后Cao從該假蜜環(huán)菌中分離純化出黃曲霉毒素氧化酶(AFO)[54];Yehia等采用了硫酸銨、DEAE-瓊脂糖凝膠柱、G-100瓊脂糖凝膠柱從平菇(Pleurotus ostreatus)中提取了錳過氧化物酶(MnP),最終酶的活力達到了81 U/mL,最適溫度在25 ℃,最適pH在4~5之間[55];Alberts在不同的液體培養(yǎng)基中研究了白腐真菌通過產(chǎn)生漆酶對黃曲霉毒素的降解[56],Loi從肺形杏鮑菇(Pleurotus pulmonarius)中分離出漆酶2,并證明了乙酰丁香酮(AS)等三種天然化合物可以增強該酶的降解效果[57]。

        在細菌中分離得到的降解酶相對較少。多數(shù)研究結(jié)果表明降解AFB1的活性物質(zhì)分布在發(fā)酵液的上清中。Zhao從橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)ANSM068中分離提純了一種胞外酶,命名為MADE,具有降解AFB1、AFG1、AFM1的能力[28];Xie等從泛菌(Pantoea sp)T6的發(fā)酵上清液中,分離純化出一種可以降解AFB1的酶,命名為PADE[39];Song等從銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)M19上清液中采用硫酸銨分級沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析分離純化了一種酶,也命名為PADE。已報道的AFB1代謝酶如表3所示。

        表1 降解黃曲霉毒素B1的細菌Table 1 Bacterium for degrading aflatoxin B1

        表2 降解黃曲霉毒素B1的真菌Table 2 Fungi for degrading aflatoxin B1

        關(guān)于微生物參與代謝AFB1關(guān)鍵基因的報道較少。在芽孢菌中,有的可能攜帶aiiA基因,它編碼N-?;呓z氨酸內(nèi)酯酶(AHL),該酶具有裂解內(nèi)酯環(huán)酯鍵的能力,因此Pereyra假設(shè)如果它們可以裂解AFB1,則是負責(zé)降解毒素的內(nèi)酯部分[59]。Afsharmanesh分析了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)UTB1的全基因組,通過比對和基因敲除等實驗證實其中的bacC基因能夠抑制黃曲霉合成黃曲霉毒素,同時也能夠降解黃曲霉毒素[60]。

        4 微生物中已知的AFB1代謝途徑

        微生物中最早報道的AFB1代謝途徑是作用在8,9-不飽和碳碳雙鍵上的氧化反應(yīng),如圖4A所示。劉大嶺團隊從假蜜環(huán)菌中分離純化出的AFO作用在AFB1的8,9-不飽和碳碳雙鍵上,首先形成AFB1-8,9-環(huán)氧化物,后又被轉(zhuǎn)化為AFB1-9-羥基二烯丙基二酚[61-62]。AFO的作用是氧依賴性,并且可以產(chǎn)生過氧化氫。后續(xù)對該產(chǎn)物進行毒性試驗,結(jié)果顯示代謝物在小鼠的肝臟里沒有毒性作用,對于鼠傷寒沙門氏菌沒有致突變性,在雞中也沒有遺傳毒性[41];Wang從白腐真菌(Phanerochaete sordida)YK-624中提取錳過氧化物酶處理AFB1,質(zhì)子核磁共振和高分辨率的電離子質(zhì)譜技術(shù)分析表明,AFB1首先被MnP氧化為AFB1-8,9-環(huán)氧化物,然后水解為AFB1-8,9-二氫二醇[63]。

        表3 黃曲霉毒素B1降解酶Table 3 Purified enzymes identified as AFB1degraders

        圖4 AFB1的代謝途徑Fig.4 Metabolic pathway of AFB1

        Samuel等報道了一株惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)能夠高效降解AFB1,代謝產(chǎn)物采取硅膠柱純化后通過紅外光譜和氣相質(zhì)譜確定其結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示代謝是從內(nèi)酯環(huán)的酯鍵水解開環(huán)開始的,脫羧形成代謝物AFD1,另外還可以形成AFD2[26]。其代謝途徑如圖4B所示。Eshelli分離得到的紅球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 4277能夠降解AFB1,經(jīng)質(zhì)譜等分析代謝產(chǎn)物,推測AFD1可能是代謝途徑中的一個中間產(chǎn)物[38]。

        一些真菌可以可以通過與AFB1的環(huán)戊烯酮環(huán)作用,將AFB1轉(zhuǎn)化成黃曲霉毒醇(AFL),其代謝途徑如圖4C所示。例如匍匐梨頭霉(Absidia repens)、樹狀指孢霉(Dactylium dendroides)、灰藍毛霉(Mucor griseo-cyanus)、根腐長孺孢(Helminthosporium sativum)[2]、木霉(Trichoderma)[49]、黑曲霉(Aspergillus niger)、黃曲霉、蠟葉散囊菌(Eurotium herbariorum)以及根霉(Rhizopus)等,其中黑曲霉又可以將AFL轉(zhuǎn)化成AFB1[2]。

        Taylor等報道了一株恥垢分枝桿菌產(chǎn)生的依賴于脫氮黃素輔助因子(F420H2)的還原酶FDR-A和FDR-B,可以還原位于黃曲霉素B1和G1上內(nèi)酯環(huán)與環(huán)戊烯酮環(huán)之間的α,β-不飽和酯上的雙鍵,得到加氫的產(chǎn)物[64]。它的代謝途徑如圖4D所示。

        5 微生物代謝AFB1的應(yīng)用基礎(chǔ)研究

        利用微生物或酶分解代謝AFB1的原理,可在實際生產(chǎn)應(yīng)用中添加活性菌或者酶制劑,以緩解飼料中AFB1給飼喂動物帶來的毒害。趙麗紅等發(fā)現(xiàn)AFB1降解菌枯草芽孢桿菌ANSB060可以在一定程度上改善黃曲霉毒素對蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的不利影響[65];范彧用肉雞實驗證實在受黃曲霉毒素污染的花生粕中添加該菌可以抵消AFB1引起雞的氧化損傷,抑制其對肝功能的毒害作用[66-67];另外,范彧也證實了在AFB1污染的鯉魚飼料中添加此菌株,能夠有效恢復(fù)鯉魚的體重,改善肝臟、胰腺等功能[68]。

        趙楊等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌N-1a在玉米青貯試驗中能夠明顯降低青貯過程中的黃曲霉毒素含量,并且判斷活性物質(zhì)是一種分泌蛋白[69];從開心果中篩選的枯草芽孢桿菌UTBSP1可以降低開心果中的AFB1[70];曹紅等基于來自假蜜環(huán)菌的黃曲霉毒素氧化酶,制成酶制劑,發(fā)現(xiàn)其能夠有效減緩AFB1對肉仔雞肝臟的損害,從而提高肉仔雞的平均日采食量,增加重量[71]。

        6 目前研究中遇到的問題和挑戰(zhàn)

        黃曲霉毒素廣泛存在于食品中,對人類的健康構(gòu)成了巨大的威脅。微生物種類多,繁殖快,是最為理想的脫毒生物類群。從微生物中篩選高效降解菌并研究其分解代謝機制一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。目前已經(jīng)分離到了包括放線菌、細菌、真菌在內(nèi)的超過幾十種微生物都可以分解代謝黃曲霉毒素,但研究過程中仍遇到不少問題和挑戰(zhàn)。首先,微生物中黃曲霉毒素的代謝途徑認識不足。目前僅有少數(shù)菌株明確了代謝途徑。對于大部分菌株來說,AFB1是通過哪些反應(yīng)形成產(chǎn)物的并不清楚。其次,微生物中發(fā)揮AFB1降解活性的物質(zhì)不清楚。已有的文獻表明一些菌株可以產(chǎn)生對蛋白酶敏感、熱力條件下穩(wěn)定的活性物質(zhì),推測是耐熱酶,但是無法成功分離該物質(zhì)[24,26,29-30]。這些活性物質(zhì)是不是酶,是哪種酶仍然不能確定。此外,由于多數(shù)菌株的解毒基因沒有成功克隆,其代謝調(diào)控機制也無從了解。由此可見,盡管明確了多種微生物能降解黃曲霉毒素的現(xiàn)象,但是對于其內(nèi)在的代謝機制問題的認識還十分欠缺,阻礙了降解微生物的實際應(yīng)用。將來還要在化合物結(jié)構(gòu)鑒定、酶的分離與純化以及功能基因分析等幾個方面加強研究,只有在分子機制研究上有所突破,才能真正推進微生物脫毒菌劑走向市場。

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