孫建波，張洪宇，龔忠闊，張 超，劉芝言，王紅蕾

（長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130012）

目前食用農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留污染極為嚴(yán)重，Barron等[1]分析了塔吉克斯坦四個(gè)農(nóng)村生食樣品中農(nóng)藥殘留，在肉類、乳制品和食用植物中檢出農(nóng)藥高殘留。2013年對(duì)波蘭谷物中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，波蘭北區(qū)谷物中農(nóng)藥殘留普遍存在[2]。Guo等[3]從浙江省的竹筍中檢測(cè)出三種類型的有機(jī)氯農(nóng)藥雙對(duì)氯苯基三氯乙烷（DDT）、六氯環(huán)己烷（HCH）和五氯硝基苯（PCNB）。Houbraken等[4]研究表明，農(nóng)藥的使用不僅導(dǎo)致農(nóng)作物中農(nóng)藥積累，在植物表面未被利用的農(nóng)藥同時(shí)可在昆蟲體內(nèi)積累，人類食用此類昆蟲同樣會(huì)對(duì)健康造成危害。

毒死蜱是一種廣譜有機(jī)磷類殺蟲劑[5]，作為高毒有機(jī)磷農(nóng)藥的替代品，具有高效低毒的特點(diǎn)，但是其缺點(diǎn)是在自然環(huán)境中半衰期較長(zhǎng)[6]。目前，傳統(tǒng)的處理毒死蜱污染的方法有物理化學(xué)法和生物降解法，物理化學(xué)法包括紫外光解[7]、化學(xué)氧化法[8]、多相光催化降解[9]及輻射降解[10]，而生物降解是利用微生物及其復(fù)合菌群，通過自身代謝將毒死蜱作為能源降解成為無(wú)毒物質(zhì)[11]。目前已經(jīng)分離出來的毒死蜱降菌株包括腸桿菌屬[12]、產(chǎn)堿桿菌屬[13]、副球菌屬[14]、芽孢桿菌屬[15、木霉屬[16]及黑曲霉屬[17]。研究表明，不同降解菌具有不同的生物活性和代謝活性，在不同程度上受到溫度、pH、底物濃度、接種量等條件的影響[18-21]，為了菌株能夠應(yīng)用到實(shí)際生活中，對(duì)菌株降解條件的優(yōu)化必不可少。

本文運(yùn)用富集馴化的方法分離可高效降解有機(jī)磷類農(nóng)藥毒死蜱的降解菌株，對(duì)菌株降解酶的定位，降解廣譜性研究，運(yùn)用正交試驗(yàn)對(duì)降解菌的降解條件進(jìn)行優(yōu)化，提高菌株的降解效率，有助于今后生物菌劑的制備，對(duì)農(nóng)藥污染環(huán)境修復(fù)及去除食用農(nóng)作物表面有機(jī)磷農(nóng)藥殘留方面極具應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 取自長(zhǎng)白山區(qū)周邊農(nóng)田土壤，土樣放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；毒死蜱乳油（純?0%）、敵敵畏乳油（純度77.5%）、甲基對(duì)硫磷乳油（純度50%）、氧化樂果乳油（純度40%）、水胺硫磷乳油（純度40%）、乙草胺乳油（純度50%）、莠去津懸浮劑（純度38%） 當(dāng)?shù)剞r(nóng)藥市場(chǎng)；毒死蜱標(biāo)品純度99.1%，上海市農(nóng)藥研究所有限公司；LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，固體培養(yǎng)基添加瓊脂18～20；MSM培養(yǎng)基（g/L）：NH4NO31.0，MgSO4·7H2O 0.5，（NH4）2SO40.5，KH2PO40.5，NaCl 0.5，K2HPO41.5。

IS-RSD3臺(tái)式恒溫振蕩器 美國(guó)精騏有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；T960PCR儀

力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；SPX-70BⅢ生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；DYY-6D型電泳儀 北京市六一儀器廠；BioDoc-It凝膠成像系統(tǒng) UVP公司；BSC-1000ⅡA2生物安全柜 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毒死蜱降解菌的富集與分離 無(wú)菌條件下稱取5 g土壤樣品，放入含有50 mg/L毒死蜱的MSM培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r/min下，培養(yǎng)7 d，隨后以5%的接種量轉(zhuǎn)接到含有100 mg/L毒死蜱的MSM培養(yǎng)基中，逐步提高毒死蜱濃度分別為200、400、600、800 mg/L，取1 mL培養(yǎng)液，進(jìn)行稀釋平板涂布，選取單菌落進(jìn)行劃線分離純培養(yǎng)。

1.2.2 毒死蜱降解菌株的鑒定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株AY-1進(jìn)行菌落形態(tài)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)。

利用試劑盒提取降解菌株基因組DNA，采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27f和1492r對(duì)降解菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5μL，dNTP Mixture 4 μL，引物各1 μL，模板2 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，加滅菌水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將所得測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，下載同源序列，利用MEGA5.0構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將保存于試管斜面中的細(xì)菌接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，作為種子液。將種子液以1%的接種量，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定菌株OD600，以O(shè)D600為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制菌株的生長(zhǎng)曲線

1.2.4 毒死蜱含量測(cè)定 挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)18 h作為種子液，以MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，37 ℃180 r/min恒溫氣浴搖床培養(yǎng)3 d，乳油加入水中后，會(huì)形成均一的溶液[22]，為保證取出樣品的均勻性，因此在培養(yǎng)結(jié)束后，取5 mL含毒死蜱的培養(yǎng)基，加入等體積的石油醚漩渦振蕩1 min，靜置分層，取上清液用于檢測(cè)[23-24]。毒死蜱于λ=293 nm左右有特征吸收峰，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品的OD293，計(jì)算樣品中毒死蜱的濃度，降解效率的計(jì)算公式為：

式中，x為毒死蜱降解效率；CA為對(duì)照樣品中毒死蜱的濃度；CX為處理樣品中毒死蜱的濃度。

1.2.5 毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 稱取一定量的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品，用石油醚作為溶劑配制成濃度為500 mg/L儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋配制濃度為1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg/L的工作液，測(cè)定工作液在OD293下的吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基及無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基接種2%種子液當(dāng)中添加毒死蜱添加濃度為 5、50和100 mg/L三個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)三次，同時(shí)做空白對(duì)照。測(cè)定毒死蜱在樣品里的不同濃度添加回收率和變異系數(shù)。

1.2.6 菌株降解酶的定位 將180 r/min，37 ℃培養(yǎng)18 h的培養(yǎng)液以8000 r/min離心10 min，收集上清液，向上清液中加入適量（NH4）2SO4至飽和度為100%，4 ℃鹽析過夜，離心收集沉淀，用pH7.0、濃度0.05 mol/L的磷酸緩沖液溶解沉淀后再用同一緩沖液透析至無(wú)NH4+，得到胞外粗酶液。

將上述離心收集的菌體，以1:3（菌體:緩沖液）的比例懸浮于緩沖液中，置于冰浴中，以超聲波破碎儀破碎15次，將處理后的菌體以8000 r/min離心10 min，上清液即為胞內(nèi)粗酶液，將上述兩種粗酶液各取1 mL加入50 mL含有100 mg/L毒死蜱的MSM培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)12 h，并設(shè)對(duì)照組，測(cè)定胞內(nèi)粗酶液和胞外粗酶液對(duì)毒死蜱的降解情況，以確定毒死蜱降解酶的位置。

1.2.7 碳源和氮源對(duì)Pseudomonas aeruginosaAY-1培養(yǎng)條件的影響

1.2.7.1 碳源對(duì)Pseudomonas aeruginosaAY-1培養(yǎng)條件的影響 挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，180 r/min條件下，振蕩培養(yǎng)18 h作為種子液，以MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以濃度為0.5%的不同碳源（蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、甘油、乙酸鈉、甘露醇）培養(yǎng)18 h，測(cè)定OD600數(shù)值。

1.2.7.2 氮源對(duì)Pseudomonas aeruginosaAY-1培養(yǎng)條件的影響 挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，180 r/min條件下，振蕩培養(yǎng)18 h作為種子液，以MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以濃度為0.1%的不同氮源（硝酸鈉、脲、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鎂）培養(yǎng)18 h，測(cè)定OD600數(shù)值。

1.2.8Pseudomonas aeruginosaAY-1降解條件的優(yōu)化

1.2.8.1 溫度對(duì)降解菌降解毒死蜱的影響 挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)18 h作為種子液，以MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，毒死蜱濃度為100mg/L，在溫度值為25、30、35、40、45 ℃，以2%接種量接種于培養(yǎng)基中，以不加菌作為對(duì)照組，pH7、180 r/min恒溫氣浴搖床培養(yǎng)3 d，測(cè)定毒死蜱降解效率。

1.2.8.2 pH對(duì)降解菌降解毒死蜱的影響 挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)18 h作為種子液，以MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，毒死蜱濃度為100 mg/L，在pH為5、6、7、8、9，以2%接種量接種于培養(yǎng)基中，以不加菌作為對(duì)照組，35 ℃、180 r/min恒溫氣浴搖床培養(yǎng)3 d，測(cè)定毒死蜱降解效率。

1.2.8.3 毒死蜱濃度對(duì)降解菌降解毒死蜱的影響挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)18 h作為種子液，以MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在毒死蜱濃度為50、100、150、200、250 mg/L，以2%接種量接種于培養(yǎng)基中，以不加菌作為對(duì)照組，35 ℃、pH7、180 r/min恒溫氣浴搖床培養(yǎng)3 d，測(cè)定毒死蜱降解效率。

1.2.8.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)溫度在30～40 ℃，pH在6～8，底物濃度在100～200 mg/L范圍時(shí)降解效果相對(duì)明顯。因此選擇30、35、40共3個(gè)溫度水平，6、7、8共3個(gè)pH水平，100、150、200共3個(gè)底物濃度水平。采用L9（34）正交試驗(yàn)方案，表1為三因素三水平正交設(shè)計(jì)，

表1 降解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Optimization of orthogonal test design for degradation conditions

1.2.9 菌株降解底物廣譜性研究 將菌株AY-1接種于含有500 mg/L敵敵畏、甲基對(duì)硫磷、氧化樂果、水胺硫磷、乙草胺和莠去津的MSM固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)之間的顯著性差異用Duncan檢驗(yàn)。采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及誤差分析。使用SPSS進(jìn)行顯著性分析，使用Oringin9進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌的分離鑒定

利用含有800 mg/L毒死蜱的MSM培養(yǎng)基篩選出1株毒死蜱降解菌，將其命名為AY-1。由圖1可知，菌株AY-1在LB固體培養(yǎng)基，呈現(xiàn)濕潤(rùn)、粘稠、不易挑起、質(zhì)地均勻。通過掃描電鏡觀察，菌株AY-1呈球桿狀。

菌株AY-1通過16S rRNA序列PCR擴(kuò)增和測(cè)序，并與Blast數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似度比較，同時(shí)調(diào)取菌株相似性最高模式菌株序列，利用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹如圖2所示，該菌株歸屬于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

2.2 毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線

以毒死蜱濃度為橫坐標(biāo)，OD293為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，回歸方程為y=59.208x-0.065，R2=0.9992，表明毒死蜱標(biāo)品在0～100 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好。

在50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，毒死蜱的濃度分別設(shè)置為 5、50和100 mg/L分別吸取一定體積的培養(yǎng)液，用1.2.1的方法進(jìn)行提取，每一濃度分別測(cè)定三次。由表2可見，不加菌的培養(yǎng)基3個(gè)濃度毒死蜱的平均添加回收率在95.84%～102.75%之間，變異系數(shù)在2.29%～3.47%之間。加菌的培養(yǎng)基3個(gè)濃度毒死蜱的平均添加回收率在95.80%～102.08%之間，變異系數(shù)在1.80%～2.27%之間。表明分析方法滿足菌株降解農(nóng)藥殘留分析的要求。

圖1 菌株AY-1菌落和菌體形態(tài)Fig.1 Colony and morphology of strain AY-1

圖2 菌株AY-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain AY-1

圖3 毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Chlorpyrifos standard curve

2.3 菌株P(guān)seudomonas aeruginosa AY-1的生長(zhǎng)曲線

圖4 為菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1的生長(zhǎng)曲線，0～2 h時(shí)，菌株生長(zhǎng)較為緩慢，處于生長(zhǎng)緩慢期，2 h后，OD600數(shù)值迅速增加，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，代謝活動(dòng)更為活躍，26 h后生長(zhǎng)速度下降，增長(zhǎng)較為緩慢。菌株的生長(zhǎng)曲線為后期微生物菌劑的制備提供條件。

2.4 降解菌毒死蜱降解酶的定位

分別測(cè)定了胞外粗酶液和胞內(nèi)粗酶液對(duì)毒死蜱的降解效率，以此來確定毒死蜱降解酶的位置，以緩沖液為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可知，胞內(nèi)粗酶液對(duì)毒死蜱的降解效率遠(yuǎn)高于胞外粗酶液，胞外粗酶液對(duì)于毒死蜱微弱的降解效率可能是由于菌體釋放部分降解物質(zhì)，由此可知菌株AY-1產(chǎn)生的毒死蜱降解酶屬于胞內(nèi)酶。

表2 毒死蜱在培養(yǎng)基中的加標(biāo)回收率Table 2 Recovery rate of chlorpyrifos in the culture medium

圖4 菌株AY-1生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of strain AY-1

表3 細(xì)菌不同位置的降解酶對(duì)毒死蜱的降解效率Table 3 Degradation efficiency of chlorpyrifos by degrading enzymes at different positions of bacteria

2.5 碳源和氮源對(duì)菌株P(guān)seudomonas aeruginosa AY-1培養(yǎng)條件的影響

2.5.1 碳源對(duì)菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1生長(zhǎng)的影響 如圖5所示，不同碳源對(duì)菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1的生長(zhǎng)影響程度不同，葡萄糖為最適碳源，其次為甘油，對(duì)蔗糖和麥芽糖的利用率較低。推測(cè)可能是不同碳源之間轉(zhuǎn)運(yùn)及分解代謝方式的不同影響了菌株對(duì)碳源的利用，進(jìn)而影響菌株生長(zhǎng)[25]。

圖5 不同碳源對(duì)菌株AY-1生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of different carbon sources on the growth of strain AY-1

2.5.2 氮源對(duì)菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1生長(zhǎng)的影響 如圖6所示，不同氮源對(duì)菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1的生長(zhǎng)影響程度不同，硫酸銨為最適氮源，其次為脲素?？赡茉蚴羌?xì)菌利用不同氮源需要不同的酶，對(duì)酶的活性有一定要求，因此菌株在不同氮源的條件下生長(zhǎng)效果不同[26]。

2.6 菌株P(guān)seudomonas aeruginosa AY-1降解特性

2.6.1 溫度對(duì)菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1降解毒死蜱的影響 溫度對(duì)AY-1降解毒死蜱的影響如圖7所示，在不同的培養(yǎng)溫度下，菌株AY-1對(duì)毒死蜱的降解效率先升高后降低。從毒死蜱隨溫度升高的降解曲線可以看出，該菌對(duì)毒死蜱降解的最適溫度范圍為30～35 ℃。其中，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)降解效率降到10%以下（P＜0.05），說明低溫和高溫對(duì)菌株降解毒死蜱都不利。這可能是因?yàn)槲⑸锏纳L(zhǎng)需要一定的環(huán)境溫度條件。溫度相對(duì)較低時(shí)，隨著溫度提升，微生物及其酶活性提高，降解效率也隨之增大；超過微生物最適溫度后，溫度的升高會(huì)導(dǎo)致微生物活性下降，甚至死亡[27]。35 ℃時(shí)，菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1對(duì)150 mg/L毒死蜱降解效率達(dá)到最大為68.3%。

圖6 不同氮源對(duì)菌株AY-1生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on the growth of strain AY-1

圖7 溫度對(duì)Pseudomonas aeruginosa AY-1降解毒死蜱的影響Fig.7 Effect of temperature on degradation of chlorpyrifos by Pseudomonas aeruginosa AY-1

2.6.2 pH對(duì)菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1降解毒死蜱的影響 pH對(duì)Pseudomonas aeruginosaAY-1降解毒死蜱的影響如圖8所示，初始pH在5～9范圍內(nèi)，AY-1對(duì)毒死蜱的降解效率先升高后降低，培養(yǎng)72 h后，pH=7時(shí)，菌株AY-1對(duì)150 mg/L毒死蜱降解效率達(dá)到最大為65%，當(dāng)pH=9時(shí)，降解效率迅速降低。pH=7～8時(shí)，Pseudomonas aeruginosaAY-1對(duì)毒死蜱有較高的效率，兩者無(wú)顯著差異（P＞0.05），可能原因?yàn)榕囵B(yǎng)體系pH的不同，會(huì)改變營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物可利用性和污染物的形態(tài)及生物毒性，從而影響微生物的活性，最終導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)速率和污染物降解速率的變化[28]。

2.6.3 底物濃度對(duì)菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1降解毒死蜱的影響 微生物對(duì)污染物的降解能力受到底物濃度的影響，特別是當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時(shí)，會(huì)抑制微生物降解酶的產(chǎn)生，從而影響微生物的降解能力，底物濃度過低時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不充足，導(dǎo)致降解效率較低[29]。底物濃度對(duì)Pseudomonas aeruginosaAY-1降解毒死蜱的影響如圖9所示，隨著底物濃度的增高降解效率隨之增高，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?50 mg/L時(shí)，降解效率達(dá)到最高為56.77%（P＜0.05）。底物濃度超過150 mg/L時(shí)，降解效率隨之降低，這說明底物濃度過高會(huì)抑制Pseudomonas aeruginosaAY-1對(duì)毒死蜱的降解。底物濃度低于150 mg/L時(shí)，隨著底物濃度增加，降解效率隨之增加。

圖8 pH對(duì)Pseudomonas aeruginosa AY-1降解毒死蜱的影響Fig.8 Effect of pH on degradation of chlorpyrifos by Pseudomonas aeruginosa AY-1

圖9 底物濃度對(duì)Pseudomonas aeruginosa AY-1降解毒死蜱的影響Fig.9 Effect of Substrate concentration on degradation of chlorpyrifos by Pseudomonas aeruginosa AY-1

2.6.4 多因素正交試驗(yàn) 正交試驗(yàn)結(jié)果由表4可知，通過正交試驗(yàn)的極差R得出A、B、C 3因素對(duì)毒死蜱降解影響的大小順序?yàn)椋築＞A＞C。這說明在菌株AY-1降解毒死蜱的過程中，pH對(duì)降解效率的影響最大，其次是溫度，底物濃度的影響最小，培養(yǎng)條件對(duì)毒死蜱降解的影響最優(yōu)組合為A2B3C1，即培養(yǎng)溫度為35 ℃，pH=8，底物濃度為100 mg/L時(shí)達(dá)到最佳降解狀態(tài)，降解效率為75.09%。

菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1經(jīng)過3 d可將100 mg/L的毒死蜱降解75.09%，相對(duì)于Shi等[30]篩選的Ochrobactrumsp.經(jīng)過7 d將100 mg/L毒死蜱降解75.18%，菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1用時(shí)更短，因此具有更好的應(yīng)用價(jià)值。本文從現(xiàn)有文獻(xiàn)中得知，從環(huán)境中分離出了多種能夠降解毒死蜱的微生物如表5。由下表可知，Pseudomonas aeruginosaAY-1是降解毒死蜱效率最高的。

2.7 菌株降解底物廣譜性研究

菌株AY-1在500 mg/L的敵敵畏、氧化樂果、甲基對(duì)硫磷、水胺硫磷、乙草胺和莠去津固體平板上均能生長(zhǎng)，如圖10所示，說明菌株AY-1對(duì)農(nóng)藥具有一定廣譜降解效果。敵敵畏、氧化樂果和水胺硫磷平板生長(zhǎng)情況良好，而在甲基對(duì)硫磷、乙草胺和莠去津平板上生長(zhǎng)較差，說明菌株AY-1對(duì)敵敵畏、氧化樂果和水胺硫磷降解潛力更大，對(duì)甲基對(duì)硫磷、乙草胺和莠去津降解潛力較低。

表4 降解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Degradation conditions optimization orthogonal test results

表5 其他毒死蜱降解微生物降解效率Table 5 Degradation efficiency of other chlorpyrifosdegrading microorganisms

3 結(jié)論

本研究從長(zhǎng)白山區(qū)農(nóng)田土中分離出一株降解毒死蜱菌株P(guān)seudomonas aeruginosaAY-1，通過形態(tài)學(xué)觀察，生理生化鑒定和16S rRNA測(cè)序，將其鑒定為銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌具有抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，因此在生物修復(fù)污染環(huán)境方面具有應(yīng)用價(jià)值。目前利用銅綠假單胞菌進(jìn)行生物修復(fù)污染環(huán)境的報(bào)道有很多，如Lu等[41]從陜西延長(zhǎng)油田下寺灣采油廠內(nèi)石油污染土中篩選出一株銅綠假單胞菌，能夠降解熒蒽，在14 d降解效率達(dá)到90.2%，對(duì)其降解酶進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚1,2-雙加氧酶在其生物降解過程中起主導(dǎo)作用；Song等[42]從經(jīng)過長(zhǎng)期擬除蟲菊酯處理的土壤中分理出一株銅綠假單胞菌，能夠高效降解甲氰菊酯。并對(duì)氯氰菊酯，溴氰菊酯，聯(lián)苯菊酯和氯氟氰菊酯都有一定的降解能力，通過鑒定降解產(chǎn)物研究了菌株對(duì)甲氰菊酯的降解機(jī)理。Hoskeri等[43]從造紙廠廢水中分離出一株銅綠假單胞菌，能夠以2 g/L 4-氯苯甲酸為生長(zhǎng)底物。

圖10 菌株AY-1在不同農(nóng)藥平板的生長(zhǎng)情況。Fig.10 Growth of strain AY-1 on different pesticide plates.

微生物降解技術(shù)是目前比較有前景的一種技術(shù)，微生物可以利用農(nóng)藥為能源，或者自身分泌特定的酶來降解農(nóng)藥及其分解產(chǎn)物。本文研究的降解菌Pseudomonas aeruginosaAY-1產(chǎn)生的降解酶為胞內(nèi)酶，Pseudomonas aeruginosAY-1對(duì)敵敵畏、氧化樂果、甲基對(duì)硫磷、水胺硫磷、乙草胺和莠去津均具有一定的降解效果，建議未來將研究方向放在固定化方面，以獲得更高效的毒死蜱降解菌株。