代艷娜，潘 虎，劉青海, ，蒲繼鋒，張一帆，白軍平，楊曉鳳

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測研究所，西藏拉薩 850032；2.四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，四川成都 610066）

吡蟲啉（imidacloprid）和啶蟲脒（acetamiprid）屬新煙堿類殺蟲劑，是全球范圍內(nèi)最重要的一類殺蟲劑，且銷量逐年攀升，具有廣譜、低毒、高效等特點，主要用于防治半翅目（如蚜蟲、粉虱、菜蝽等）和鱗翅目（如菜青蟲、甜菜夜蛾、小菜蛾、斜紋夜蛾等）等果蔬害蟲，可干擾昆蟲神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的傳導，從而導致昆蟲麻痹及死亡[1-3]。吡蟲啉和啶蟲脒等新煙堿類殺蟲劑已在全球120多個國家登記，約占殺蟲劑銷售額的18.2%，占全球農(nóng)藥市場的5.3%，我國是全球最大的新煙堿類殺蟲劑生產(chǎn)、使用和出口國[4]。吡蟲啉和啶蟲脒等農(nóng)藥的長期、大量使用造成蚜蟲、飛虱等農(nóng)業(yè)害蟲對其抗性逐漸增強[5-6]，同時部分動物實驗表明，吡蟲啉和啶蟲脒具有一定的生殖毒性，肝毒性，神經(jīng)毒性及遺傳毒性等[7-8]，具有一定的潛在毒害風險，因此歐盟、巴西、美國、加拿大等國已對部分該類農(nóng)藥做出禁限用措施[9-10]。近年來，吡蟲啉和啶蟲脒在我國蔬菜上的使用量顯著增加，因而其在蔬菜中的殘留逐漸引起各方的重視。

目前，有關(guān)該類農(nóng)藥的殘留及消解動態(tài)規(guī)律研究主要集中在低海拔的果蔬種植大區(qū)[11-12]，國內(nèi)外學者對新型煙堿類殺蟲劑在果蔬中的殘留消解規(guī)律進行了部分研究。Muccio等[13]采用 SPE/LC-ESIMS法測定了蔬菜和水果中的吡蟲啉殘留量；Khay等[14]采用HPLC-UVD 法研究了大白菜中吡蟲啉的消解動態(tài)與最終殘留；李慧冬等[15]研究了啶蟲脒在甘藍中的殘留消解動態(tài)；王明明等[16]對吡蟲啉在番茄中的殘留動態(tài)進行了分析；盧陽陽等[17]對青菜中吡蟲啉、啶蟲脒及噻蟲嗪的殘留吸附動力學進行了探討。西藏自治區(qū)拉薩市地處青藏高原腹地，高寒、缺氧、強日照等特殊的自然環(huán)境與低海拔地區(qū)四川省彭州市的溫和、濕潤、多霧的自然環(huán)境差異較大，導致吡蟲啉和啶蟲脒等農(nóng)藥在兩地區(qū)間存在較大差異[18]。部分研究顯示，葉類蔬菜農(nóng)藥殘留概率相對其他種類蔬菜較大[19-21]，農(nóng)藥多噴灑于蔬菜葉面，葉類蔬菜葉面表面積大，因此相對其他蔬菜品種出現(xiàn)農(nóng)藥殘留的概率較大。探討高、低海拔對吡蟲啉和啶蟲脒在葉類設(shè)施蔬菜中的殘留和消解規(guī)律的影響，對明確高海拔地區(qū)葉類蔬菜中吡蟲啉和啶蟲脒的殘留、消解動態(tài)及其半衰期，指導高海拔地區(qū)蔬菜生產(chǎn)者合理合規(guī)施用吡蟲啉和啶蟲脒等新型煙堿類殺蟲劑具有重要的實際應(yīng)用價值。

本文在西藏拉薩市和四川彭州市開展了吡蟲啉和啶蟲脒在大白菜、快白菜、生菜、西芹等四種葉類設(shè)施蔬菜中的殘留和消解規(guī)律分析，對助力高原地區(qū)食用農(nóng)產(chǎn)品合格證制度主體承諾制試行，確保高原地區(qū)蔬菜質(zhì)量安全具有重要研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

吡蟲啉農(nóng)藥 10%可濕性粉劑，江蘇藍豐生物化工股份有限公司；啶蟲脒農(nóng)藥 40%水分散粒劑，江西中訊農(nóng)化有限公司；四季王大白菜種子、法國皇后西芹種子 鳳鳴雅世種業(yè)有限公司；意大利生菜種子、寒春快菜種子 昆明市華興種業(yè)有限公司；吡蟲啉、啶蟲脒標準溶液 濃度1000 μg/mL，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境環(huán)境保護科研監(jiān)測所；甲醇、乙腈 色譜純，美國Fisher公司；氯化鈉 分析純，成都市科隆化學品有限公司；乙酸銨 色譜純，美國Dikma公司；有機系濾膜 0.22 μm，島津技邇上海商貿(mào)有限公司。

超高效液相色譜（ACQUITY UPLC H-class）美國Waters公司；CAPCELL PAK MG Ⅲ-H C18色譜柱（3 μm，2.0 mm I.D.×100 mm） 日本資生堂公司；API 4500 Qtrap三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；CombiMax K600蔬菜粉碎機 德國Braun公司；T18勻漿機 德國IKA公司；JA2003N電子天平 上海菁海儀器有限公司；Milli-Q超純水制備系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 田間試驗 2018年6月～2020年5月在西藏拉薩市（海拔：3667 m）和四川彭州市（海拔：593 m）設(shè)施蔬菜基地開展相關(guān)殘留試驗，試驗設(shè)計參照NY/T 788-2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》[22]和NY/T 3094-2017《植物源性農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留貯藏穩(wěn)定性試驗準則》[23]。

1.2.1.1 最終殘留試驗 設(shè)3個重復試驗小區(qū)，每個小區(qū)面積約50 m2，各試驗小區(qū)間設(shè)保護隔離區(qū)，另設(shè)清水空白對照區(qū)。按照采收期倒推施藥時間，根據(jù)NY/T 788-2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》[22]，采用供試農(nóng)藥推薦的使用劑量的最大推薦劑量，按照吡蟲啉300 ga.i/ha和啶蟲脒56.25 ga.i/ha的劑量噴霧施藥2次，施藥間隔7 d，于末次施藥后3、5、7、10、21 d采集蔬菜整株樣待測。

1.2.1.2 消解動態(tài)試驗 設(shè)3個重復試驗小區(qū)，每個小區(qū)面積約50 m2，各試驗小區(qū)間設(shè)保護隔離區(qū)，另設(shè)清水空白對照區(qū)。四種葉菜約生長到成熟個體1/2時，按吡蟲啉450 ga.i/ha（最大推薦劑量1.5倍）[22]、啶蟲脒84.38 ga.i/ha（最大推薦劑量1.5倍）[22]的劑量均勻噴霧施藥1次，于施藥后的2 h，1、2、3、5、7、10、14、21 d采集蔬菜莖葉待測。

1.2.2 樣品采集、運輸、制備和儲存 隨機采集2份蔬菜樣品，每份樣品不少于12個個體且不少于2 kg。蔬菜鮮樣2 h內(nèi)運至實驗室，去除表面泥土和明顯腐壞、萎蔫部位后，切段、勻漿，留取約250 g樣品于-20 ℃保藏、備用。

1.2.3 樣品前處理 稱取25.00 g（精確至0.01 g）樣品于250 mL燒杯中，加入50 mL乙腈，12000 r/min高速勻漿2 min，用定量濾紙快速過濾至裝有5～7 g氯化鈉的具塞試管中，劇烈振蕩1 min，室溫靜置30 min，精確吸取上層乙腈相溶液1 mL，加入1 mL甲醇水溶液（1:1，V:V），渦旋混勻后過0.22 μm微孔濾膜，裝瓶待測。

1.2.4 儀器條件 色譜條件：CAPCELL PAK MGⅢ-H C18色譜柱（3 μm，2.0 mm I.D.×100 mm）；進樣體積3 μL；柱溫35 ℃；流動相A相為含0.1%甲酸的0.2 mmol/L乙酸銨水溶液，B相為甲醇，流速0.3 mL/min；洗脫梯度：1.0 min、30% B，2.5 min、40% B，4.5 min、30% B。

質(zhì)譜條件：采用ESI正離子MRM監(jiān)測模式，霧化氣流速50.0 L/h，輔助加熱氣流速50.0 L/h，氣簾氣流速30.0 L/h，噴霧電壓5500 V，輔助加熱氣溫度550 ℃[24]。離子對和碰撞能量參數(shù)見表1。

表1 吡蟲啉和啶蟲脒的特征監(jiān)測離子Table 1 Characteristic ions of imidacloprid and acetamiprid

1.2.5 標準工作曲線制作和添加回收試驗 標準工作曲線：分別精確移取0.5 mL的吡蟲啉和啶蟲脒標準溶液（1000 μg/mL）于10 mL棕色容量瓶中，乙腈定容，得到50 mg/L標準儲備液，再分別移取1.0 mL的吡蟲啉和啶蟲脒標準儲備液于同一個10 mL棕色容量瓶中，乙腈定容，得到5 mg/L的混合標準溶液。用空白基質(zhì)稀釋混合標準溶液，得到質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3和0.5 mg/L的混合標準工作液，以質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。

添加回收試驗：在四種葉菜空白樣品中添加一定量的混合標準溶液，兩種農(nóng)藥的添加水平均為0.01、0.10和0.50 mg/kg，重復5次，按1.2.3 和 1.2.4章節(jié)所述方法進行樣品前處理及上機測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Analyst（AB SCIEX）軟件 1.6.2 控制儀器和數(shù)據(jù)采集，MultiQuant 3.0.2 軟件（AB SCIEX）進行數(shù)據(jù)處理，WPS 2019 進行數(shù)據(jù)匯總和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)效應(yīng)的消除及典型色譜圖

在實際樣品分析中，目標化合物的共洗脫組分會影響電噴霧離子源的離子化效率，從而引起的分析信號的抑制或增強，是LC－MS/MS 定量分析中的產(chǎn)生誤差的根本原因[25-27]。本試驗采用基質(zhì)配制標準樣品來補償實際樣品溶液對目標農(nóng)藥產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)，四種葉類蔬菜基質(zhì)中吡蟲啉和啶蟲脒的典型TIC圖譜如圖1所示，結(jié)果顯示，在1.2.4液相色譜-質(zhì)譜條件下吡蟲啉和啶蟲脒均能較好地分離，未出現(xiàn)雜質(zhì)干擾峰，其響應(yīng)值均較好，能夠確保檢測結(jié)果的準確性。

2.2 方法線性范圍和檢出限

標準曲線在0.005～0.500 mg/L范圍內(nèi)兩種農(nóng)藥呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.9976～0.9996，以定量離子信噪比S/N≥3得到目標化合物的檢出限（LOD）為0.11～1.21 μg/kg，以S/N≥10得到定量限（LOQ）為0.38～0.69 μg/kg，能夠滿足儀器分析相關(guān)系數(shù)要求（表2）。

2.3 方法準確度和精密度

添加回收試驗結(jié)果表明，吡蟲啉和啶蟲脒的回收率在81.22%～116.95%，RSD在1.2%～7.1%，結(jié)果均符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》要求。當濃度0.005 mg/kg＜C≤0.01 mg/kg時，回收率均在81.22%～92.54%之間，相對標準偏差≤5.8%，當濃度0.01 mg/kg＜C≤0.10 mg/kg時，回收率均在82.42%～104.46%之間，相對標準偏差≤5.9%，當濃度0.10 mg/kg＜C≤0.50 mg/kg時，回收率均在100.93%～116.95%之間，相對標準偏差≤7.1%。該檢測方法用于四種葉類蔬菜中吡蟲啉和啶蟲脒的殘留分析準確可靠（表3）。

2.4 消解動態(tài)試驗結(jié)果

在西藏拉薩市和四川彭州市設(shè)施蔬菜基地開展的消解動態(tài)試驗結(jié)果顯示，兩地的消解動態(tài)曲線均呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系，滿足一級動力學方程Ct=C0e-kt（圖2）。農(nóng)藥原始沉積量、半衰期、動力學方程、相關(guān)系數(shù)見表4。由表4中可知，啶蟲脒在高海拔設(shè)施蔬菜基地的四種葉菜中的原始沉積量普遍低于在低海拔設(shè)施蔬菜基地的四種葉菜中的原始沉積量，吡蟲啉在高海拔設(shè)施蔬菜基地的大白菜和快白菜中的原始沉積量略高于低海拔地區(qū)設(shè)施蔬菜基地的大白菜和快白菜，而在西芹和生菜中反而低于低海拔地區(qū)，但吡蟲啉和啶蟲脒在不同海拔地區(qū)的4種葉類蔬菜上的原始沉積量總體上差異性較小，說明農(nóng)藥原始沉積量跟海拔高度沒有明顯相關(guān)性。半衰期結(jié)果顯示，吡蟲啉和啶蟲脒在不同海拔地區(qū)的四種蔬菜中的半衰期由短到長依次為生菜、快白菜、大白菜、西芹，吡蟲啉和啶蟲脒在高海拔地區(qū)的4種葉類蔬菜中的半衰期較低海拔地區(qū)縮短，其中啶蟲脒在拉薩設(shè)施基地的西芹中的消解半衰期為4.6 d，而在彭州設(shè)施蔬菜基地的西芹中消解半衰期為8.7 d，兩者相差較大，可能是由于拉薩地區(qū)日照強度大，導致該地區(qū)設(shè)施蔬菜中的農(nóng)藥降解速率較快，其次農(nóng)藥降解還與蔬菜品種對其吸附能力有關(guān)[28-29]。

2.5 最終殘留試驗結(jié)果

圖1 吡蟲啉和啶蟲脒在四種葉類蔬菜中的的典型TIC色譜圖（0.01 mg/L）Fig.1 TIC chromatogram of imidacloprid and acetamiprid in four kinds of leaf vegetables (0.01 mg/L)

表2 吡蟲啉和啶蟲脒在四種葉類蔬菜中的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficient (r), detection limits and quantitative limits of imidacloprid and acetamiprid in four kinds of leaf vegetables

表3 吡蟲啉和啶蟲脒在四種基質(zhì)中回收率及相對標準偏差（n=5）Table 3 Recoveries and RSD of imidacloprid and acetamiprid in four kinds of leaf vegetables (n=5)

圖2 吡蟲啉和啶蟲脒在四種作物中的消解動態(tài)趨勢Fig.2 Degradation dynamics of imidacloprid and acetamiprid in four leaf vegetables

表4 吡蟲啉和啶蟲脒在四種作物上的消解動態(tài)及半衰期Table 4 Degradation dynamics and half-life of imidacloprid and acetamiprid in four leaf vegetables

按最大推薦劑施藥2次，施藥間隔期7 d，吡蟲啉和啶蟲脒在拉薩試驗點的四種葉類蔬菜中的殘留量分別為0.00～0.610 mg/kg和0.00～1.637 mg/kg（表5）。試驗結(jié)果顯示，第二次施藥7 d后，吡蟲啉和啶蟲脒均在西芹中的殘留量最大，拉薩市和彭州市所有蔬菜中的兩種農(nóng)藥均符合最大殘留限量（MRL）標準[30]，2種農(nóng)藥在四種葉類蔬菜中的安全風險較小。在相同施藥條件下，拉薩市四種葉類蔬菜的農(nóng)藥殘留情況優(yōu)于彭州市。

3 結(jié)論

本研究建立了簡便、快捷、高效的吡蟲啉和啶蟲脒在四種葉類蔬菜中的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜殘留分析方法，該方法重現(xiàn)性較好，準確度和精密度等均符合農(nóng)藥殘留分析方法要求。同時，首次探討了西藏拉薩市和四川彭州市四種葉類蔬菜中吡蟲啉和啶蟲脒的殘留消解差異，研究結(jié)果顯示吡蟲啉和啶蟲脒在拉薩市4種葉類蔬菜中的半衰期均短于彭州市4種葉類蔬菜中的半衰期，但兩種農(nóng)藥半衰期的長短在不同海拔地區(qū)的4種葉類蔬菜中無顯著差異，即拉薩市和彭州市中吡蟲啉和啶蟲脒的半衰期由短到長均為生菜＜快白菜＜大白菜＜西芹，兩種農(nóng)藥的殘留及消解動態(tài)與蔬菜品種及不同海拔的種植環(huán)境有密切關(guān)聯(lián)。在相同施藥條件下，拉薩市四種葉類蔬菜的農(nóng)藥殘留情況優(yōu)于彭州市，其原因可能是由于拉薩地區(qū)日照強度大，導致該地區(qū)設(shè)施蔬菜中的農(nóng)藥原始沉積量較低及降解速率較快，高海拔地區(qū)較低海拔地區(qū)為農(nóng)藥殘留低風險區(qū)域。

表5 吡蟲啉和啶蟲脒在四種葉菜中的殘留量Table 5 Residual quantity of imidacloprid and acetamiprid in four leaf vegetables