趙明明，許文青，陶凱歌，劉宇杰，劉美英，姚瑞芹

徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州 221004

癲癇是以反復(fù)癇性發(fā)作為特征的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全球癲癇患者年增長240萬左右，其中兒童期患者最多，患病率為0.4%～0.9%［1-2］。近年來，中藥在治療癲癇方面由于其低不良反應(yīng)和顯著療效，引起醫(yī)藥界重視［3］。石菖蒲是臨床上廣泛用于治療癲癇的一種中藥材，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)α-細(xì)辛醇是石菖蒲的核心代謝效應(yīng)物，并設(shè)計(jì)合成了α-細(xì)辛醇及其衍生物，已獲得國家專利。司替戊醇是一種臨床上用于難治性兒童癲癇Dravet綜合征治療的“孤兒藥”，其可通過抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶（LDH）的活性來控制癲癇發(fā)作［4］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，α-細(xì)辛醇可顯著抑制LDH活性，且同摩爾劑量下優(yōu)于陽性藥司替戊醇［5-6］。2019年7月—2020年7月，我們觀察了α-細(xì)辛醇對(duì)癲癇幼鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 健康清潔級(jí)新生11 d的SD大鼠30只，體質(zhì)量21～29 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（魯）2014007。主要試劑：α-細(xì)辛醇（西北大學(xué)），氯化鋰、匹魯卡品（美國Sigma公司），阿托品（上海陶素生化科技有限公司），兔抗GFAP一抗（Protenintech公司），山羊抗兔熒光二抗（美國Abcam公司）。主要儀器：正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司），Odyssey激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）。

1.2 動(dòng)物分組與模型建立 將30只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、溶劑對(duì)照組、陽性對(duì)照組和α-細(xì)辛醇組，每組6只，雌雄不拘。正常組不處理，其余各組制備癲癇模型。造模方法：腹腔注射氯化鋰（125 mg/kg），18～20 h后 腹 腔注 射 匹 魯卡 品（30 mg/kg）誘導(dǎo)癲癇發(fā)作。根據(jù)Racine相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)造模進(jìn)行分級(jí)［7］，將Ⅳ級(jí)及以上癲癇發(fā)作定義為造模成功。如未達(dá)到造模成功標(biāo)準(zhǔn)，則每30 min重復(fù)腹腔注射匹魯卡品10 mg/kg，重復(fù)3次及以上者剔除，本研究均注射一次造模成功。造模成功后持續(xù)觀察幼鼠40 min，注射阿托品1 mg/kg，10 min后按體質(zhì)量200 mg/kg注射水合氯醛終止癲癇發(fā)作。

1.3 藥物干預(yù) 溶劑對(duì)照組、陽性對(duì)照組和α-細(xì)辛醇組分別在給予匹魯卡品前15 min腹腔注射50 mg/kg Tween80、司替戊醇和α-細(xì)辛醇，正常組、模型組腹腔注射等體積生理鹽水。每日給藥3次，連續(xù)7 d。

1.4 幼鼠海馬組織標(biāo)本獲取 每組取3只幼鼠在給藥7 d后全麻，仰臥位固定，剪開胸腔充分暴露心臟；將灌注針插入心尖部，剪破右心耳后灌注。快速灌注生理鹽水溶液，直至肝臟逐漸變?yōu)榘咨?、右心耳流出清亮液體；以4%多聚甲醛固定液灌注血管，待幼鼠抽動(dòng)停止、全身組織和器官僵硬后停止灌注。斷頭取腦，放入4%多聚甲醛中固定12～24 h。固定后的腦組織先后經(jīng)15%、30%蔗糖溶液脫水，待大腦完全沉入30%蔗糖后取出。在冰凍切片機(jī)內(nèi)用OCT將腦組織進(jìn)行包埋，并進(jìn)行海馬組織連續(xù)冠狀切片，切片厚度約30μm，用于尼氏染色、免疫熒光染色。各組剩余幼鼠在全麻下冰上快速斷頭處死，取海馬部位腦組織并稱重，放入-80℃冰箱備用，用于Western blotting檢測。

1.5 幼鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)觀察 采用尼氏染色法。各組取切片5張，經(jīng)二甲苯及梯度乙醇處理，蒸餾水沖洗后置于1%甲苯胺藍(lán)染液中浸染30 min。蒸餾水沖洗后于95%乙醇中分化2～3 min，使用無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察并攝片。

1.6 幼鼠海馬組織GFAP蛋白檢測 ①免疫熒光染色：各組取5張與尼氏染色相鄰的切片，0.01 mol/L PBS沖洗、晾干后，加封閉液37℃封閉40 min；切片晾干，滴加一抗，室溫放置30 min，4℃過夜。取出切片，復(fù)溫、沖洗、晾干后，避光滴加熒光二抗，室溫孵育2 h；沖洗后滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染劑室溫放置5 min，用PBS沖洗、晾干。加甘油緩沖液封片，在顯微鏡下觀察GFAP蛋白陽性顆粒（紅色熒光）的表達(dá)情況并攝片。采用Image J軟件分析圖像積分光密度（IOD）值并計(jì)算平均光密度（MOD）。MOD=IOD/圖片總面積（AREA）。MOD值越高，表示GFAP表達(dá)越高。②Western blotting：每50 mg腦組織加入200μL蛋白裂解液和2μL蛋白酶抑制劑，充分勻漿后4℃離心機(jī)離心，取上清層分裝。按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，并按最低濃度配平各組蛋白濃度。上清內(nèi)加入相應(yīng)量的蛋白上樣緩沖液，沸水浴15 min后分裝備用。配置10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上樣后經(jīng)凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至NC膜上。轉(zhuǎn)移后用5%脫脂奶粉封閉，然后滴加GFAP一抗（稀釋比例1∶5 000）孵育，4℃過夜。洗膜后，滴加熒光標(biāo)記的山羊抗兔抗體（稀釋比例1∶5 000），37℃反應(yīng)2 h。洗膜3次后用Odyssey激光成像系統(tǒng)掃描圖像，用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以-x±s表示，組間比較行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組海馬組織神經(jīng)元形態(tài)比較 正常組海馬CA1和CA3區(qū)可見大量致密的錐體細(xì)胞，神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)完整，染色質(zhì)分布均勻；尼氏染色均勻、無凝集、無分散。造模7 d后的模型組與溶劑對(duì)照組海馬CA1和CA3區(qū)尼氏染色減弱，部分神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)不完整，細(xì)胞腫脹或皺縮，輪廓模糊，界限不清；細(xì)胞間距增加，排列疏松紊亂。與模型組相比，陽性對(duì)照組和α-細(xì)辛醇組海馬CA1和CA3區(qū)多數(shù)錐體細(xì)胞邊緣清晰，形態(tài)基本正常，神經(jīng)元排列整齊呈條帶狀，尼氏染色較均勻。見OSID碼圖1。

2.2 各組海馬組織GFAP蛋白表達(dá)比較

2.2.1 各組海馬組織免疫熒光染色結(jié)果比較 海馬CA1和CA3區(qū)GFAP蛋白陽性顆粒及MOD值模型組、溶劑對(duì)照組＞陽性對(duì)照組、α-細(xì)辛醇組＞正常組（P均＜0.05）；模型組與溶劑對(duì)照組、陽性對(duì)照組與α-細(xì)辛醇組GFAP MOD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1、OSID碼圖2。

表1 各組幼鼠GFAP蛋白MOD值比較（-x±s）

2.2.2 各組海馬組織Western blotting檢測結(jié)果比較 正常組、模型組、溶劑對(duì)照組、陽性對(duì)照組、α-細(xì)辛醇組GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.59±0.02、0.88±0.05、0.91±0.05、0.60±0.05、0.59±0.04；模型組、溶劑對(duì)照組＞陽性對(duì)照組、α-細(xì)辛醇組＞正常組（P均＜0.05），模型組與溶劑對(duì)照組、陽性對(duì)照組與α-細(xì)辛醇組GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見OSID碼圖3。

3 討論

癲癇是兒童多發(fā)的腦神經(jīng)失調(diào)性疾病，藥物治療仍為目前癲癇的主要治療方法。臨床上廣泛運(yùn)用的西醫(yī)抗癲癇藥（AEDs）有菲爾氨酯、拉莫三嗪、司替戊醇、普瑞巴林等，而這些藥物僅能起到60%～80%的療效，始終無法根治癲癇，依然有30%～40%的患者會(huì)惡化成難治性癲癇［8］。長期服用AEDs還可能出現(xiàn)諸多不良反應(yīng)，如惡心、頭痛、失調(diào)、神經(jīng)性厭食、肝損傷、腸功能紊亂、困倦等。目前，藥物的不良反應(yīng)以及患者對(duì)藥物產(chǎn)生的耐藥性已成為現(xiàn)有AEDs治療失敗的主要原因［9］。Dravet綜合征是一種比較復(fù)雜且難以根治的疾病，屬于難治性兒童癲癇。因此，開發(fā)多（新）靶點(diǎn)、低毒性、低不良反應(yīng)且適于兒童服用的藥物兼具緊迫性與挑戰(zhàn)性［10］。

中藥治療癲癇早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有記載，中醫(yī)基礎(chǔ)理論認(rèn)為癲癇屬于癇病范疇。隨著研究的不斷深入，中藥在治療癲癇方面由于其療效顯著、不良反應(yīng)小，逐漸被臨床廣泛應(yīng)用。迄今為止，2015版《中國藥典》共收錄14種抗癲癇中藥復(fù)方及制劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，α-細(xì)辛醇作為“遠(yuǎn)志－石菖蒲”藥對(duì)及化學(xué)藥“α-細(xì)辛腦膠囊”的核心代謝效應(yīng)物，與現(xiàn)有AEDs的結(jié)構(gòu)顯著不同，是一種全新的抗癲癇活性分子骨架；其對(duì)多種類型的動(dòng)物癲癇模型有較好抗癲癇活性、較低神經(jīng)毒性，具有良好的開發(fā)優(yōu)勢(shì)，值得繼續(xù)深入研究［11］。

神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖是癲癇的特征性病理改變，而在各種膠質(zhì)細(xì)胞中星形膠質(zhì)細(xì)胞占50%～60%。星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅能回收和釋放神經(jīng)遞質(zhì)，緩沖細(xì)胞外鉀離子，參與血腦屏障和突觸的形成，還參與神經(jīng)傳遞和代謝調(diào)節(jié)，為神經(jīng)元提供穩(wěn)定的微環(huán)境［12］。越來越多的研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇發(fā)生與發(fā)展過程中扮演了重要角色，星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活或增殖會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外神經(jīng)遞質(zhì)、代謝酶、離子濃度等變化，進(jìn)而參與癲癇的發(fā)病過程［13-16］。因此，通過干預(yù)功能失調(diào)的星形膠質(zhì)細(xì)胞可能是治療癲癇新的潛在治療策略。

本研究以SD大鼠幼鼠為研究對(duì)象，利用氯化鋰—匹魯卡品制備幼鼠癲癇模型，用石菖蒲核心代謝物α-細(xì)辛醇連續(xù)給藥7 d，觀察海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的變化。結(jié)果顯示，α-細(xì)辛醇對(duì)癲癇幼鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)改變和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化有抑制作用。這提示α-細(xì)辛醇能夠減緩氯化鋰—匹魯卡品誘導(dǎo)癲癇幼鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷并抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而抑制癲癇的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)為α-細(xì)辛醇作為一種新的抗難治性癲癇藥物的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其具體抗癲癇作用的機(jī)制以及神經(jīng)毒性還需要進(jìn)一步研究。