何偉偉，王豆，李濤，周瑞，閆詠梅

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽 712046；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育）陜西省創(chuàng)新藥物研究中心

抑郁癥以顯著而持續(xù)的心境低落為主要特征，臨床表現(xiàn)包括情緒焦慮、睡眠障礙、運(yùn)動(dòng)及精神遲緩、自責(zé)自罪及有自殺念頭等。WHO統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，全球抑郁癥和惡劣心境患者發(fā)病率為12.8%，抑郁癥已成為全球性的重大醫(yī)療疾患［1］。目前對于抑郁癥的治療以化學(xué)藥物為主，但其治療效果存在一定局限性，如起效慢、容易反復(fù)發(fā)作等，還有一些患者存在對抗抑郁化學(xué)藥物無反應(yīng)的情況。中醫(yī)學(xué)將抑郁癥歸于郁病范疇，對于郁病的治療早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中已有論述。近年來，中醫(yī)藥在治療抑郁癥方面顯示出了獨(dú)特的優(yōu)勢。其中柴胡能疏肝解郁、和解表里、升舉陽氣，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗抑郁、抗炎、抗腫瘤等作用［2］；石菖蒲主風(fēng)寒濕痹、咳逆上氣、開心孔、補(bǔ)五臟、通九竅、明耳目、出音聲，具有抗抑郁、抗癲癇、抗癡呆、改善學(xué)習(xí)記憶、抗驚厥等作用［3］。柴胡、石菖蒲配伍（柴胡—石菖蒲）在抑郁癥的治療與研究中應(yīng)用廣泛，但目前研究多集中于對柴胡、石菖蒲單體作用成分的分析，而對其聯(lián)合后多成分、多靶點(diǎn)作用機(jī)制研究較少。2020年5月17日—10月21日，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的有效成分及潛在作用機(jī)制，以期為中醫(yī)藥治療抑郁癥研究提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 柴胡—石菖蒲活性成分及作用靶點(diǎn)篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TC‐MSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索柴胡、石菖蒲的有效化學(xué)成分，以口服利用度（OB）≥30%、化合物類藥性（DL）≥0.18為條件篩選柴胡—石菖蒲活性成分；從平臺收集其相關(guān)作用靶點(diǎn)，并通過Uni‐prot蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org）進(jìn)行蛋白名標(biāo)準(zhǔn)化。采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建柴胡—石菖蒲活性成分—作用靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)圖，使用Net‐work analyzer工具對柴胡—石菖蒲主要活性成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析。網(wǎng)絡(luò)圖中圓形節(jié)點(diǎn)表示活性成分，菱形節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，邊表示成分和靶點(diǎn)間的相互關(guān)聯(lián)；Degree表示活性成分與靶點(diǎn)的相互關(guān)聯(lián)的數(shù)目，圓形節(jié)點(diǎn)面積越大表示Degree值越大，Degree值越大代表該活性成分生物功能越多，重要性越強(qiáng)。

1.2 抑郁癥靶點(diǎn)收集和篩選 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org）、OMIM數(shù)據(jù) 庫（http：//www.omim.org）收集治療抑郁癥的潛在靶點(diǎn)。靶點(diǎn)Score值越高代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系越密切，設(shè)定Score大于中位數(shù)的靶點(diǎn)為在抑郁癥中發(fā)揮相對重要作用的靶點(diǎn)。合并2個(gè)數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)，刪去重復(fù)靶點(diǎn)并在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白名標(biāo)準(zhǔn)化，得到抑郁癥靶點(diǎn)。

1.3 柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心靶點(diǎn)分析 通過Venny 2.1.0在線繪圖軟件將柴胡—石菖蒲成分作用靶點(diǎn)與抑郁癥靶點(diǎn)取交集并制作韋恩圖，再將兩者交集靶點(diǎn)上傳到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org），生物種類設(shè)定為Homo sapiens，最小相互作用閾值設(shè)為highest confidence（＞0.9），獲取蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)。將所得信息導(dǎo)入Cyto‐scape 3.7.2軟件，利用內(nèi)置工具Network analyzer進(jìn)行分析，根據(jù)Degree＞10篩選核心靶點(diǎn)并繪制柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心靶點(diǎn)的可視化PPI網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)中的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，邊代表蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，節(jié)點(diǎn)面積越大、顏色越紅代表該靶點(diǎn)生物學(xué)重要性越強(qiáng)。

1.4 核心靶點(diǎn)的GO生物過程和KEGG通路富集分析 將獲取的柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心靶點(diǎn)上傳至生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）平臺，物種設(shè)定為人，Select Identifier設(shè)定為OFFICIAL GENE SYMBOL，List Type設(shè)定為Gene List，對柴胡—石菖蒲抗抑郁靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物過程和KEGG通路富集分析，取P＜0.01且Count≥15的結(jié)果對柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測。

1.5 柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心成分分析 根據(jù)P＜0.01篩選KEGG通路富集分析中排名最前的20條通路，采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建柴胡—石菖蒲活性成分—抑郁癥靶點(diǎn)—信號通路可視化網(wǎng)絡(luò)圖，通過Cytoscape 3.7.2內(nèi)置工具Network analyzer分析活性成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，進(jìn)一步明確柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的核心成分。網(wǎng)絡(luò)圖中圓形節(jié)點(diǎn)表示藥物活性成分，菱形節(jié)點(diǎn)表示潛在核心靶點(diǎn)，倒三角形節(jié)點(diǎn)表示作用通路，邊表示藥物活性成分與潛在靶點(diǎn)以及潛在靶點(diǎn)與作用通路間的相互作用關(guān)系，節(jié)點(diǎn)面積越大表示該節(jié)點(diǎn)生物學(xué)重要性越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 柴胡—石菖蒲活性成分及作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果 TCMSP中共收集柴胡活性成分349種、石菖蒲活性成分105種，符合OB≥30%且DL≥0.18的柴胡活性成分12種、石菖蒲活性成分4種。共收集275個(gè)柴胡成分作用靶點(diǎn)、68個(gè)石菖蒲成分作用靶點(diǎn)，刪除柴胡、石菖蒲中重復(fù)的成分靶點(diǎn)后，再將兩種藥物成分靶點(diǎn)取交集，得到172個(gè)作用靶點(diǎn)。柴胡—石菖蒲中的主要活性成分為槲皮素、異鼠李素、山奈酚、豆甾醇、8-異戊烯基山奈酚等，見表1。柴胡—石菖蒲中發(fā)揮相對重要作用的靶點(diǎn)為原癌基因JUN、腫瘤壞死因子（TNF）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、腫瘤蛋白p53（TP-53）等，見OSID碼圖1。

2.2 抑郁癥靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫收集抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)11 479個(gè)，經(jīng)Score大于中位數(shù)篩選后獲得靶點(diǎn)1 946個(gè)，合并OMIM數(shù)據(jù)庫中抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)并去重復(fù)后，共獲得抑郁癥靶點(diǎn)1 960個(gè)。

2.3 柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心靶點(diǎn)分析結(jié)果 將172個(gè)藥物成分靶點(diǎn)與1 960個(gè)抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)合并、取交集，得到98個(gè)柴胡—石菖蒲治療抑郁癥靶點(diǎn)。進(jìn)一步篩選出柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核 心 靶 點(diǎn)21個(gè)，包 括AKT1、JUN、TNF、TP-53、MAPK1、白細(xì)胞介素6（IL-6）、MAPK8、表皮生長因子 受 體（EGFR）、MAPK14、c-fos原 癌 基 因 蛋 白（FOS）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、趨化因子8（CXCL8）、雌激素受體1（ESR1）、白細(xì)胞介素1B（IL-1B）、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白1（RB1）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）、半胱天冬酶8（CASP8）、IL-2、表皮生長因子（EGF）、CCL2、蛋白激酶Cβ（PRKCB）。見OSID碼圖2。

表1 柴胡—石菖蒲的主要活性成分

2.3 核心靶點(diǎn)的GO生物過程和KEGG通路富集分析結(jié)果 GO生物過程分析共得到生物過程470條，其中P＜0.01且Count≥15的生物過程共12條，分別為RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、對藥物的應(yīng)答、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、炎癥應(yīng)答、衰老、血管再生、氧化還原過程。KEGG信號通路分析共獲得信號通路123條，其中P＜0.01且Count≥15的信號通路共16條，包括腫瘤途徑、乙型肝炎、TNF信號通路、恰加斯病、弓形體病、甲型流感、肺結(jié)核、缺氧誘導(dǎo)因子1信號通路、Toll樣受體信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號通路、MAPK信號通路、癌癥蛋白多糖、丙型肝炎、黏著斑、人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型感染、癌癥微小RNAs。

2.4 柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心成分分析結(jié)果 柴胡—石菖蒲活性成分—抑郁癥靶點(diǎn)—信號通路網(wǎng)絡(luò)中共包括133個(gè)節(jié)點(diǎn)、528條邊，見OSID碼圖3。柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的核心成分Degree值從高到低依次為槲皮素、8-異戊烯基山奈酚、山奈酚、豆甾醇、異鼠李素。見表2。

表2 柴胡—石菖蒲治療抑郁癥核心成分網(wǎng)絡(luò)參數(shù)分析結(jié)果

3 討論

柴胡具有疏肝解郁之功，是治療郁病的要藥，在四逆散、逍遙散、柴胡疏肝散等許多理氣劑中均有重要作用。石菖蒲豁痰開竅、醒神益智，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有治療作用［4］。柴胡—石菖蒲在臨床治療抑郁癥中應(yīng)用廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，將柴胡皂苷與石菖蒲提取液聯(lián)合運(yùn)用，可顯著增強(qiáng)石菖蒲水提液和醇沉液治療抑郁癥的效果［5］。本研究通過分析柴胡—石菖蒲的活性成分及作用靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，兩種藥物共有16種活性成分，172個(gè)作用靶點(diǎn)，槲皮素、8-異戊烯基山奈酚、山奈酚、豆甾醇、異鼠李素為柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的核心成分，其中山奈酚為柴胡—石菖蒲所共有的活性成分。研究顯示，槲皮素可改善促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）誘導(dǎo)的大鼠焦慮、抑郁樣行為［6］。炎癥反應(yīng)與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，當(dāng)核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）通路過度激活時(shí)，可引起炎癥反應(yīng)并進(jìn)一步影響情緒中樞，可能會(huì)導(dǎo)致抑郁樣行為［7］。而8-異戊烯基山奈酚作為NF-κB通路的抑制劑，對由NF-κB調(diào)節(jié)的典型炎癥基因表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用［8］。研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚能改善抑郁模型大鼠海馬的損傷，并能減少海馬神經(jīng)元凋亡［9］。另有研究顯示，在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）發(fā)揮重要作用［10］；而豆甾醇能顯著提高海馬ERK和CREB的表達(dá)水平，從而改善抑郁癥狀［11］。研究表明，異鼠李素可以降低前額葉皮質(zhì)、海馬膽堿酯酶及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的活性，增強(qiáng)膽堿信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和突觸可塑性，通過改善神經(jīng)功能、增強(qiáng)認(rèn)知和記憶從而預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾?。?2］。

柴胡—石菖蒲治療抑郁癥靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)顯示，JUN、AKT1、TNF、TP53、MAPK1、IL-6等核心靶點(diǎn)在柴胡—石菖蒲對于抑郁癥的治療中具有相對重要的作用。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，AKT1、MAPK1靶點(diǎn)可能是抗抑郁治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)［13-15］。研究發(fā)現(xiàn)，JUN與抑郁癥關(guān)系密切，其可能是抗抑郁藥物發(fā)揮作用的傳導(dǎo)物質(zhì)；此外，還發(fā)現(xiàn)其與抑郁癥主要發(fā)病機(jī)制之一的神經(jīng)再生有關(guān)［16］。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，IL-6基因是抑郁障礙的重要易感基因，單相與雙相抑郁發(fā)作患者的血清IL-6水平顯著升高，并與其病情的嚴(yán)重程度一致［17-18］。

GO生物學(xué)過程富集分析顯示，柴胡—石菖蒲治療抑郁癥主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程等生物學(xué)過程。KEGG信號通路富集分析顯示，PI3K-AKT、MAPK、Toll樣受體信號通路等信號通路可能為柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的關(guān)鍵通路。PI3K-AKT信號通路在抑郁癥的發(fā)病過程中具有重要作用，突觸可塑性是抑郁癥發(fā)病機(jī)制之一，PI3KAKT信號通路可通過影響突觸可塑性緩解抑郁癥狀［19］。此外，抑郁患者海馬損傷與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加有關(guān)，而PI3K-AKT可通過抑制NF-κB信號通路抑制細(xì)胞凋亡，從而起到抗抑郁作用［20］。研究顯示，MAPK信號通路可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡影響抑郁癥的發(fā)生并參與抗抑郁藥物的治療機(jī)制［21］。目前已經(jīng)證明的MAPK信號通路共有5條，其中與抑郁癥關(guān)系最為密切的是ERK1/2信號通路，該信號通路為抗抑郁藥物首要作用目標(biāo)，也是參與細(xì)胞可塑性的重要途徑［22］。神經(jīng)發(fā)生是抑郁癥發(fā)病機(jī)制之一。研究表明，通過調(diào)控細(xì)胞增殖、分化以及凋亡，Toll樣受體信號通路可影響神經(jīng)發(fā)生、軸突生長和結(jié)構(gòu)重塑，從而起到抗抑郁作用［23］。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對柴胡—石菖蒲治療抑郁癥的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索，其中涉及了多種成分、靶點(diǎn)、生物過程及信號通路。柴胡—石菖蒲的活性成分可通過JUN、AKT1、TNF等核心靶點(diǎn)作用于RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程及PI3K-AKT、MAPK等信號通路，協(xié)同發(fā)揮治療抑郁癥的作用。