楊萬荷，李家群，張東艷，王昌高，昝慧

1海南省人民醫(yī)院，?？?570100；2?？谑腥嗣襻t(yī)院

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其早期癥狀不典型且復(fù)發(fā)率較高，導(dǎo)致許多患者的生存預(yù)后不佳［1］。化療是胃癌綜合治療的重要部分，術(shù)后化療有助于消滅局部微小轉(zhuǎn)移灶，減少腫瘤局部復(fù)發(fā)。但部分患者術(shù)后化療過程中出現(xiàn)對化療藥物耐藥的現(xiàn)象，導(dǎo)致治療效果不佳。細(xì)胞耐藥與藥物代謝異常、DNA修復(fù)功能增強(qiáng)及細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)基因表達(dá)異常相關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確［2］。因此，有必要深入研究胃癌耐藥發(fā)生的機(jī)制，尋找新的診斷治療靶點(diǎn)。微小RNA106a-5p（miR-106a-5p）是miR-17家族成員之一，其在結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，可影響轉(zhuǎn)化生長因子β2受體等基因表達(dá)，從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［3-4］。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2（ERK2）屬于MAP激酶家族成員，可參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育等多種細(xì)胞過程。研究表明，ERK2在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，與患者不良預(yù)后相關(guān)［5-6］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，卵巢癌及甲狀腺癌細(xì)胞中抑制miR-106a-5p表達(dá)后，ERK2表達(dá)顯著上調(diào)，腫瘤細(xì)胞增殖及遷移能力增強(qiáng)且對化療藥物順鉑（DDP）的耐藥性提高［7-8］。2018年10月—2020年1月，我們通過建立胃癌DDP耐藥細(xì)胞株MGC-803/DDP，初步探討miR-106a-5p靶向調(diào)控ERK2對胃癌DDP耐藥性的影響并分析其可能機(jī)制，以期為臨床胃癌化療耐藥患者的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料 胃癌細(xì)胞系MGC-803購自中國協(xié)和細(xì)胞庫，DDP購自Hospira公司。主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶、4%多聚甲醛固定液、結(jié)晶紫染液均購自北京索萊寶公司。Cyclin D1、Caspase3、ERK2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MDR1一抗均購自Abcam公司。二抗HRP-linked anti-rabbit IgGantibody購自Cell Signaling Technology公司。EdU增殖檢測試劑盒及Hoechst33258染色試劑盒購自上海一研生物公司。Annexin-V試劑盒購自MultiSciences公司。PI購自PeproTech公司。FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自BD Biosciences公司。Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning公司。Matrigel基質(zhì)膠購自BD公司。RNeasy Plus Mini Kit購自Qiagen公司。SYBR?Green PCR Master Mix購自ABI公司。miRNA RT試劑盒購自海南基因公司。miR-106a-5p模擬物（miR-106a-5p mimic）、ERK2過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-ERK2）、ERK2野生型質(zhì)粒（ERK2-WT）、ERK2突變型質(zhì)粒（ERK2-MUT）、對照質(zhì)粒（NCmimic）均購自華大基因公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及DDP耐藥細(xì)胞株建立 將胃癌細(xì)胞系MGC-803置于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)MGC-803細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，將DDP由0.5 mg/L開始誘導(dǎo)，每48 h更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，即達(dá)到對數(shù)生長期后，梯度增加25%的DDP濃度，直到細(xì)胞能夠穩(wěn)定存活于5 mg/L的DDP培養(yǎng)基中并能夠連續(xù)傳代培養(yǎng)，表明MGC-803/DDP耐藥細(xì)胞株建立成功。

1.3 細(xì)胞miR-106a-5p、ERK2 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR法。取對數(shù)生長期的MGC-803及MGC-803/DDP細(xì)胞，以1×106/mL接種至6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)80%后按照Qiagen RNeasy Plus Mini Kit說明提取MGC-803及MGC-803/DDP細(xì)胞總RNA，使用miRNA RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用SYBR?Green PCR Master Mix在Bio-Rad CFX 96 Touch實時PCR檢測系統(tǒng)上進(jìn)行RT-PCR分析。miR-106a-5p QRT-PCR參數(shù)設(shè)置：95℃10 s，95℃10 s，60℃30 s，在70℃延伸10 s，共40個循環(huán)；ERK2 QRT-PCR參數(shù)設(shè)置：95℃10 s，95℃40 s，60℃60 s，70℃10 s，共35個循環(huán)。引物序列：miR-106a-5p上游引物5′-GATGCTCAAAAAGTGCTTA‐CAGTGCA-3′、下 游 引 物5′-TATGGTTGTTCT‐GCTCTCT-3′，內(nèi)參U6上游引物5"-CTCGCTTCG‐GCAGCACA-3、下 游 引 物5"-CCAGTGCAGGGTCC‐GAGGTAT-3"；ERK2上游引物5′-TGGATTCGACT‐TAGACTTGACCT-3′、下游引物5′-GGTGGGTTATG‐GTCTTCAAAAGG-3′，內(nèi) 參β-actin上 游 引 物5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′、下 游 引 物5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′。以U6、β-actin為內(nèi)參，按照2－ΔΔCt計算miR-106a-5p及ERK2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 miR-106a-5p與ERK2靶向調(diào)控關(guān)系分析 采用在線生物學(xué)信息學(xué)軟件結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測及熒光素酶報告基因?qū)嶒?。使用在線生物學(xué)信息學(xué)軟件star‐Base（http：//starbase.sysu.edu.cn/）和Targetscan7.2（http：//www.targetscan.org/vert_72/）預(yù)測程序預(yù)測miR-106a-5p與ERK2是否存在結(jié)合位點(diǎn)；將MGC-803/DDP細(xì)胞以5×104/孔接種到24孔板中，接種12 h后隨機(jī)分為4組，分別進(jìn)行ERK2-WT、ERK2-MUT與miR-106a-5p mimic、NCmimic的共轉(zhuǎn)染，室溫孵育48 h后，使用雙熒光素酶測定系統(tǒng)（Promega公司）和微板發(fā)光計（Berthold公司）測定熒光素酶活性。

1.5 細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染 將MGC-803/DDP細(xì)胞以1×106/mL鋪至6孔板，分為mimic組（轉(zhuǎn)染miR-106a-5p mimic）、ERK2組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ERK2）、mimic+ERK2組（共轉(zhuǎn)染miR-106a-5p mimic和pcDNA3.1-ERK2）、NC組（不轉(zhuǎn)染），每組設(shè)3個復(fù)孔。采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑按照分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后收集4組細(xì)胞，參照“1.3”采用RT-PCR法檢測miR-106a-5p、ERK2表達(dá)。結(jié)果顯示，mimic組miR-106a-5p相對表達(dá)量（30.09±3.39）高于NC組（0.51±0.11），ERK2組ERK2相對表達(dá)量（10.23±1.58）高于NC組（3.10±0.36），mimic+ERK2組miR-106a-5p、ERK2相對表達(dá)量（27.13±3.14、6.12±1.29）均高于NC組（P均＜0.05），提示轉(zhuǎn)染成功。

1.6 細(xì)胞增殖能力觀察 采用EdU染色實驗。收集“1.5”中轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，換液后加入20μmol/L的DDP，24 h后棄液，PBS清洗3次，各孔加入200μL EdU培養(yǎng)基（細(xì)胞培養(yǎng)基與EdU溶液按1 000∶1稀釋），孵育2 h，棄培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞2次。各孔加入100μL細(xì)胞固定液（含4%多聚甲醛的PBS）室溫孵育30 min，棄固定液；加入100μL 2 mg/mL甘氨酸，搖床孵育5 min；加入200μL PBS，搖床清洗5 min，棄液；加入200μL 1×Apollo?染色反應(yīng)液，避光、室溫、搖床孵育30 min；加入100μL滲透劑（0.5%TritonX-100的PBS），搖床清洗2～3次，每次10 min。DNA染色：各孔加入200μL 1×Hoechst 33342反應(yīng)液，避光、室溫、搖床孵育30 min，加入200μL PBS清洗3次。染色完成后立即進(jìn)行熒光顯微鏡DNA復(fù)制活性檢測，EdU陽性細(xì)胞數(shù)越多說明細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.7 細(xì)胞凋亡水平觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集“1.5”中各組細(xì)胞，在37℃下進(jìn)行胰蛋白酶消化處理1 min；每組收集1×106～3×106個細(xì)胞，冷PBS清洗2次；4℃下離心5 min，重懸于500μL凋亡陽性對照緩沖液中，冰上孵育30 min；冷PBS清洗，去上清。加入適量預(yù)冷1×結(jié)合緩沖液重懸，加入數(shù)量相同且未經(jīng)處理的腫瘤細(xì)胞與之混合。加入預(yù)冷1×結(jié)合緩沖液補(bǔ)充至1.5 mL，等分為3管（空白對照管1管、單染管2管）。單染管分別加入5μL Annexin VFITC及10μL PI，室溫下避光孵育5 min。將5μL Annexin-V-FITC溶液加入細(xì)胞中，并在室溫下避光孵育15 min。在流式細(xì)胞儀上用空白對照管調(diào)節(jié)FSC、SSC和熒光通道電壓，進(jìn)行流式分析，通過FITC檢 測 通 道（Ex=488 nm；Em=530 nm）檢 測Annexin-V-FITC，通過PI檢測通道（Ex=535 nm；Em=615 nm）檢測PI。使用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡，BDFACSCantoTM系統(tǒng)軟件測定細(xì)胞凋亡數(shù)。

1.8 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell實驗。制備基質(zhì)膠鋪板：將基質(zhì)膠Matrigel用RPMI1640培養(yǎng)基以1∶8稀釋，37℃下放置30 min使Matrigel聚合成凝膠；基底膜水化后，將Matrigel包被24孔板Tran‐swell小室底部膜的上室面。制備細(xì)胞懸液：胰酶消化細(xì)胞，含血清培養(yǎng)基終止消化后離心棄去培養(yǎng)液；用PBS清洗1～2遍，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL，用無血清培養(yǎng)基重懸。細(xì)胞接種：取100μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，下室加入600μL含20%FBS的培養(yǎng)基。放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，甲醇固定30 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，PBS清洗3遍。400倍顯微鏡下隨機(jī)5個視野觀察細(xì)胞，采用鏡下直接計數(shù)法計算膜下室側(cè)貼壁細(xì)胞數(shù)，貼壁細(xì)胞數(shù)越多表示細(xì)胞侵襲能力越強(qiáng)。

1.9 細(xì)胞增殖凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白及耐藥基因檢測 采用Western blotting法。將各組細(xì)胞以1×105/孔鋪至6孔板，待細(xì)胞貼壁后加入20μmol/L DDP處理24 h；PBS清洗2遍，加入含蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，提取細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后，加入上樣緩沖液，99℃水浴10 min后進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳（濃縮膠恒壓80 V、分離膠恒壓120 V、恒壓80 V轉(zhuǎn)印2 h）。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中封閉2 h，加入增殖凋亡相關(guān)蛋白（Cyclin D1、Caspase3）、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白（Ecadherin、N-cadherin、Vimentin）、耐藥基因（MDR1）一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過夜；加入二抗（稀釋比例1∶5 000），室溫孵育1 h。采用ECL暗室顯影照相，Image J軟件分析條帶灰度值，計算各蛋白相對表達(dá)量。

1.10 細(xì)胞DDP耐藥性檢測 采用MTT法。收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，消化重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL；接種至96孔板，加入細(xì)胞懸液100μL，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；分別加入濃度為40、20、2、0.2、0.02μg/mL的DDP，每個藥物濃度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置不接種細(xì)胞的空白對照孔及不加藥物的對照孔，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d；加入20μL MTT，4 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測570 nm處各孔光密度（OD）值，取各復(fù)孔OD值的平均值計算各濃度DDP對各組細(xì)胞生長的抑制率。抑制率=（對照孔OD值－實驗孔OD值）/對照孔OD值×100%，根據(jù)抑制率計算各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。IC50越低，說明細(xì)胞對DDP治療越敏感，即耐藥性越低。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較行單因素方差分析，兩組比較行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞中miR-106a-5p、ERK2 mRNA表達(dá)比較 MGC-803/DDP細(xì)胞中miR-106a-5p相對表達(dá)量低于MGC-803細(xì)胞，ERK2 mRNA相對表達(dá)量高于MGC-803細(xì)胞（P均＜0.05）。見表1。

2.2 miR-106a-5p與ERK2的調(diào)控關(guān)系 預(yù)測顯示，ERK2基因序列445～452個堿基位置存在與miR-106a-5p的結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。共轉(zhuǎn)染miR-106a-5p mimic+ERK2-WT或NCmimic+ERK2-WT的MGC-803/DDP細(xì)胞熒光素酶活性分別為1.91±0.29、3.39±0.51（P＜0.01），共 轉(zhuǎn) 染miR-106a-5p mimic+ERK2-MUT或NCmimic+ERK2-MUT的MGC-803/DDP細(xì)胞熒光素酶活性分別為3.51±0.49、3.61±0.59（P＞0.05），提示miR-106a-5p可靶向負(fù)調(diào)控ERK2。

表1 MGC-803、MGC-803/DDP細(xì)胞中miR-106a-5p、ERK2 mRNA表達(dá)比較（-x±s）

圖1 miR-106a-5p與ERK 2結(jié)合位點(diǎn)

2.3 各組細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲能力比較 EdU陽性細(xì)胞數(shù)ERK2組＞NC組＞mimic+ERK2組＞mimic組，細(xì)胞凋亡數(shù)mimic組＞NC組＞mimic+ERK2組＞ERK2組，貼壁細(xì)胞數(shù)ERK2組＞NC組＞mimic+ERK2組＞mimic組（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞Ed U陽性細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞凋亡數(shù)、貼壁細(xì)胞數(shù)比較（個，-x±s）

2.4 各組細(xì)胞增殖凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白及耐藥基因表達(dá)比較 Cyclin D1、N-cadherin、Vimentin、MDR1表達(dá)ERK2組＞mimic+ERK2組＞NC組＞mimic組，Caspase3、E-cadherin表 達(dá)mimic組＞mimic+ERK2組＞NC組＞ERK2組（P均＜0.05）。見表3。

2.5 各組細(xì)胞DDP耐藥性比較 mimic組、ERK2組、mimic+ERK2組、NC組IC50分別為（1.51±0.08）、（7.58±0.14）、（3.67±0.12）、（4.46±0.11）μg/mL，ERK2組＞NC組＞mimic+ERK2組＞mimic組（P均＜0.05）。

3 討論

我國胃癌發(fā)病率較高，胃癌的發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)約占全球總病例數(shù)的50%［9］。以鉑類為基礎(chǔ)的化療是晚期胃癌綜合治療的重要手段，但臨床用藥過程中存在耐藥，甚至多藥耐藥，嚴(yán)重影響治療效果。胃癌耐藥機(jī)制的形成較為復(fù)雜，與DNA修復(fù)功能增強(qiáng)、藥物靶點(diǎn)改變、幽門螺桿菌感染及細(xì)胞藥泵效應(yīng)或解毒效應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)［10］。因此，研究DDP耐藥性的機(jī)制，尋找逆轉(zhuǎn)DDP耐藥性的方法，可能是提高DDP耐藥的胃癌患者化療療效的關(guān)鍵。

表3 各組細(xì)胞增殖凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白及耐藥基因表達(dá)比較（-x±s）

ERK2是一種細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，參與細(xì)胞增殖、分化和發(fā)育等生物學(xué)過程。研究顯示，腫瘤中的ERK2能夠被細(xì)胞膜相應(yīng)受體如血管內(nèi)皮生長因子受體、轉(zhuǎn)化生長因子β受體過度磷酸化激活，由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，激活下游激酶，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性增殖的同時產(chǎn)生對化療藥物的耐藥性［11］。miR-106a-5p是miR-106a的剪切成熟體，其能夠通過調(diào)控細(xì)胞表面Fas相關(guān)絲蘇氨酸激酶的活性，影響下游ERK1/2的表達(dá)及活性，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡［12］。有學(xué)者報道，鼻咽癌腫瘤細(xì)胞中miR-106a-5p表達(dá)水平升高能夠通過下調(diào)ERK2信號傳導(dǎo)通路的激活來逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞化療耐藥［13］。因此，miR-106a-5p可能通過直接下調(diào)ERK2表達(dá)逆轉(zhuǎn)MGC-803/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性。為驗證該假設(shè)，我們首先檢測了MGC-803及MGC-803/DDP中miR-106a-5p及ERK2 mRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)MGC-803/DDP細(xì)胞中miR-106a-5p表達(dá)降低、ERK2 mRNA表達(dá)升高。通過生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-106a-5p與ERK2 mRNA的3"UTR存在連續(xù)結(jié)合的位點(diǎn)，熒光素酶報告實驗進(jìn)一步確認(rèn)miR-106a-5p能夠靶向抑制ERK2 mRNA的表達(dá)。因此，我們推測miR-106a-5p/ERK2可能在MGC-803/DDP耐藥細(xì)胞株中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。為進(jìn)一步驗證該假設(shè)，本研究通過在MGC-803/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ERK2過表達(dá)質(zhì)?；騧iR-106a-5p模擬物，觀察其對細(xì)胞增殖凋亡及侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，miR-106a-5p mimic能夠靶向ERK2降低DDP處理下MGC-803/DDP細(xì)胞的增殖及侵襲能力，提高細(xì)胞凋亡水平，提示miR-106a-5p能夠通過靶向抑制ERK2表達(dá)逆轉(zhuǎn)MGC-803/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性。另外，miR-106a-5p亦可通過其他分子機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞對DDP的耐藥性。研究顯示，抑制miR-106a表達(dá)能通過靶向上調(diào)多囊腎病基因2表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞G1/S期阻滯，增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對DDP的耐藥性，而上調(diào)miR-106a后腫瘤細(xì)胞對DDP的敏感性升高［14］。

為進(jìn)一步探討miR-106a-5p通過ERK2逆轉(zhuǎn)MGC-803/DDP細(xì)胞對DDP耐藥性的具體機(jī)制，我們檢測了各組MGC-803/DDP細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)蛋白Cyclin D1、Caspase3的表達(dá)，結(jié)果顯示，與ERK2組比較，mimic+ERK2組及mimic組Cyclin D1表達(dá)均較低，而Caspase3表達(dá)均較高；而mimic+ERK2組Cyclin D1表達(dá)較mimic組高，Caspase3表達(dá)較mimic組低。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞周期失控相關(guān)，細(xì)胞周期的進(jìn)行依賴于一系列正負(fù)調(diào)節(jié)因子的作用，包括細(xì)胞周期素（如Cyclin D1等）和細(xì)胞周期素依賴激酶抑制蛋白。Cyclin D1可推動細(xì)胞周期由G1期進(jìn)展到S期，而細(xì)胞周期素依賴激酶抑制蛋白可抑制細(xì)胞從G1期到S期過渡。有研究報道，結(jié)直腸癌細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)增加可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性，而抑制Cyclin D1表達(dá)能夠增強(qiáng)化療敏感性［15］。本研究結(jié)果亦提示，miR-106a-5p能夠通過靶向抑制ERK2，導(dǎo)致Cyclin D1表達(dá)降低，從而抑制MGC-803/DDP細(xì)胞的增殖能力。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。本研究顯示，miR-106a-5p能夠增加Caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MGC-803/DDP細(xì)胞凋亡。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，主要表現(xiàn)為維持細(xì)胞之間黏附的上皮性表型如E-cadherin表達(dá)水平降低，而間質(zhì)性表型如N-cadherin及Vimentin表達(dá)升高，導(dǎo)致細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［16］。研究顯示，腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤化療耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)信號通路的激活可參與腫瘤耐藥性的形成，靶向上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的治療可能是克服腫瘤耐藥的新思路［17］。此外，有學(xué)者在舌鱗癌的研究中發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Twist能夠促進(jìn)間質(zhì)性標(biāo)志物N-cadherin及Vimentin表達(dá)升高，并促進(jìn)鱗癌細(xì)胞對DDP耐藥性的形成［18］。有研究報道，ERK2是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的關(guān)鍵上游信號分子，并且是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的重要分子［19］。本研究結(jié)果顯示，miR-106a-5p可通過靶向抑制ERK2活性導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin及Vimentin表達(dá)升高，從而抑制MGC-803/DDP細(xì)胞的侵襲能力。本研究對耐藥基因MDR1水平的檢測結(jié)果同樣顯示，miR-106a-5p可靶向ERK2使MDR1表達(dá)水平降低，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)MGC-803/DDP細(xì)胞的耐藥性。

綜上所述，miR-106a-5p能夠通過靶向抑制ERK2表達(dá)降低MGC-803/DDP細(xì)胞增殖、侵襲能力，增加MGC-803/DDP細(xì)胞凋亡水平并逆轉(zhuǎn)其耐藥性，該機(jī)制可能與改變增殖凋亡相關(guān)蛋白Cyclin D1和Caspase3表達(dá)、逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程、降低耐藥基因MDR1表達(dá)水平有關(guān)。