潘喜峰，馬艷菊，唐域，趙艤航，于淼淼，王賀

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽(yáng) 110042

肺癌包括小細(xì)胞肺癌（SCLC）與非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），發(fā)病率與病死率較高［1］。隨著表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑和免疫檢查點(diǎn)抑制劑等藥物成功用于臨床，NSCLC患者的預(yù)后有了顯著改善［2］，但是SCLC的相關(guān)研究較少。因此，對(duì)SCLC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行更深入地研究與探索，尋找SCLC潛在治療靶點(diǎn)，具有重要臨床意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可通過(guò)表觀遺傳修飾［3］、LncRNA-miRNA相互作用［4］、LncRNA-蛋白相互作用等多種機(jī)制調(diào)控基因的表達(dá)［5］。LINC00665作為L(zhǎng)ncRNA的一員，在乳腺癌［6］、前列腺癌［7］中表達(dá)上調(diào)，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，但是LINC00665在SCLC中的功能及作用機(jī)制尚不清楚。miR-186-5p在骨肉瘤［8］、結(jié)直腸癌［9］中表達(dá)顯著下調(diào)，可通過(guò)調(diào)控下游的mRNA抑制腫瘤進(jìn)展。通過(guò)StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，miR-186-5p是LINC00665的潛在靶點(diǎn)。SHAN等［10］在肝細(xì)胞癌（HCC）中發(fā)現(xiàn)LINC00665可以介導(dǎo)miR-186-5p，從而抑制HCC細(xì)胞的凋亡和自噬。但是，二者在SCLC中是否也存在調(diào)控關(guān)系尚不明確。2019年5月—2021年1月，我們觀察了LINC00665在SCLC細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的影響，并分析在此過(guò)程中LINC00665與miR-186-5p是否存在調(diào)控關(guān)系，為研究LINC00665在SCLC發(fā)病過(guò)程中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞及試劑：SCLC細(xì)胞H1688和正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invit‐rogen公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，BEBM培養(yǎng)基購(gòu)于瑞士Lonza公司，TB Green Premix Ex TaqTMⅡ及PrimeScriptTMRT Master Mix均購(gòu)于日本Takara公司，LINC00665過(guò)表達(dá)片段、LINC00665陰性序列片段、miR-186-5p過(guò)表達(dá)片段均購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。實(shí)驗(yàn)儀器：超低溫冰箱（TSE240V-ULTS，德 國(guó)Thermo），多 功 能 酶 標(biāo) 儀（LABTECH PHERAstar FS，德國(guó)BMG），超微量分光光度計(jì)（DS-11FX，美國(guó)Denovix），高速冷凍離心機(jī)（5804R，德國(guó)Eppendorf），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96 Touch，美國(guó)BIO-RAD）。

1.2 H1688、BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng) 將H1688、BEAS-2B細(xì)胞分別接種于RPMI-1640、BEBM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，1～2 d更換一次新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)器皿生長(zhǎng)面時(shí)，取出培養(yǎng)器皿，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。

1.3 LINC00665在H1688、BEAS-2B細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取H1688、BEAS-2B細(xì)胞，通過(guò)TRIzol試劑分別提取細(xì)胞的總RNA；使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩⒖既嗽碙INC00665及U6在Gen Bank中的基因序列，選擇同源性高的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成。引物序列：LINC00665上游為5′-GAGGACTCAGAGGTGGAATT-3′，下 游 為5′-GA‐CAGCCAGCTTGTAGGG-3′；U6上游為5′-GCTTCG‐GCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行操作，以U6為內(nèi)參，按2－ΔΔCt計(jì)算LINC00665相對(duì)表達(dá)量。

1.4 LINC00665對(duì)H1688細(xì)胞增殖、侵襲及miR-186-5p表達(dá)影響的觀察。

1.4.1 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1688細(xì)胞分為三組，LINC00665過(guò)表達(dá)組和陰性序列組分別按照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染LINC00665過(guò)表達(dá)序列和對(duì)照序列48 h，對(duì)照組不轉(zhuǎn)染。

1.4.2 細(xì)胞增殖活性觀察 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，離心重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，以5×103/孔接種于96孔板，并設(shè)復(fù)孔，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。分別在0、24、48、72 h時(shí)，在不同復(fù)孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的OD值，以此表示細(xì)胞增殖活性。

1.4.3 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，離心重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，以5×104/孔接種于上室，將含有10%FBS的培養(yǎng)基置于下室，上下室內(nèi)培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，并在上室側(cè)鋪有一層基質(zhì)膠。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，將附著在下表面的穿膜細(xì)胞固定并染色；在顯微鏡下5個(gè)區(qū)域中計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，取平均數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。

1.4.4 細(xì)胞中miR-186-5p表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，操作方法同“1.3”。引物序列：miR-186-5p上游為5′-GCG‐GATCCGAGCCATGCTTATGCTACTG-3′，下游為5′-GCGCGGCCGCCCAGGTATATGGCA-3′，由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成；以U6為內(nèi)參，按2－ΔΔCt計(jì)算miR-186-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.5 LINC00665與miR-186-5p在H1688細(xì)胞增殖、侵襲中的調(diào)控關(guān)系分析

1.5.1 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1688細(xì)胞另分為三組，LINC00665過(guò)表達(dá)組和miR-186-5p+LINC00665過(guò)表達(dá)組分別按照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染LINC00665過(guò)表達(dá)序列、miR-186-5p+LINC00665過(guò)表達(dá)序列48 h，對(duì)照組不轉(zhuǎn)染。

1.5.2 miR-186-5p對(duì)細(xì)胞中LINC00665表達(dá)影響的觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞中LINC00665表達(dá)量，方法同“1.3”。

1.5.3 miR-186-5p對(duì)LINC00665過(guò)表達(dá)所致H1688細(xì)胞增殖、侵襲影響的觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，采用MTT法觀察細(xì)胞增殖情況，方法同“1.4.2”；采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲能力，方法同“1.4.3”。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較行t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H1688、BEAS-2B細(xì)胞中LINC00665表達(dá)比較LINC00665在H1688細(xì)胞中的表達(dá)量為10.66±1.19，高于BEAS-2B細(xì)胞中的1.01±0.03（P＜0.05）。

2.2 LINC00665對(duì)H1688細(xì)胞增殖的影響LINC00665過(guò)表達(dá)組除0 h外，同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞OD值高于陰性序列組和對(duì)照組（P均＜0.05），陰性序列組與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞OD值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 LINC00665對(duì)H1688細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 LINC00665對(duì)H1688細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05；與陰性序列組同時(shí)點(diǎn)比較，#P＜0.05。

組別LINC00665過(guò)表達(dá)組陰性序列組對(duì)照組細(xì)胞OD值0 h 0.25±0.03 0.27±0.04 0.25±0.02 24 h 0.87±0.02*#0.52±0.02 0.54±0.03 48 h 1.26±0.03*#0.84±0.04 0.83±0.05 72 h 1.74±0.05*#1.11±0.08 1.17±0.07

2.3 LINC00665對(duì)H1688細(xì)胞侵襲的影響 LINC00665過(guò)表達(dá)組、陰性序列組、對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（139.33±3.06）、（25.67±2.08）、（26.33±2.31）個(gè)，LINC00665過(guò)表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)多于陰性序列組和對(duì)照組（P均＜0.05），陰性序列組與對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

圖1 LINC00665對(duì)H1688細(xì)胞侵襲的影響（Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)）

2.4 LINC00665對(duì)H1688細(xì)胞中miR-186-5p表達(dá)的影響 LINC00665過(guò)表達(dá)組、陰性序列組、對(duì)照組細(xì)胞中miR-186-5p表達(dá)量分別為0.54±0.03、1.02±0.02、1.05±0.04，LINC00665過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中miR-186-5p表達(dá)量低于陰性序列組和對(duì)照組（P均＜0.05），陰性序列組與對(duì)照組細(xì)胞中miR-186-5p表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 LINC00665與miR-186-5p在H1688細(xì)胞增殖、侵襲中的調(diào)控關(guān)系

2.5.1 miR-186-5p對(duì)細(xì)胞中LINC00665表達(dá)的影響 細(xì)胞中LINC00665表達(dá)量，LINC00665過(guò)表達(dá)組（1.95±0.09）＞miR-186-5p+LINC00665過(guò)表達(dá)組（1.46±0.08）＞對(duì)照組（0.99±0.04），P均＜0.05。

2.5.2 miR-186-5p對(duì)LINC00665過(guò)表達(dá)所致細(xì)胞增殖的影響 除0 h外同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞OD值，LINC00665過(guò)表達(dá)組＞miR-186-5p+LINC00665過(guò)表達(dá)組＞對(duì)照組，P均＜0.05。見(jiàn)表2。

表2 miR-186-5p對(duì)LINC00665過(guò)表達(dá)所致H1688細(xì)胞增殖的影響（±s）

表2 miR-186-5p對(duì)LINC00665過(guò)表達(dá)所致H1688細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05；與miR-186-5p+LINC00665過(guò)表達(dá)組同時(shí)點(diǎn)比較，#P＜0.05。

組別miR-186-5p+LINC00665過(guò)表達(dá)組LINC00665過(guò)表達(dá)組對(duì)照組細(xì)胞OD值0 h 0.22±0.02 0.24±0.03 0.21±0.03 24 h 0.59±0.05 0.85±0.06*#0.55±0.05 48 h 0.94±0.06 1.29±0.07*#0.86±0.05 72 h 1.37±0.08 1.77±0.09*#1.16±0.07

2.5.3 miR-186-5p對(duì)LINC00665過(guò)表達(dá)所致細(xì)胞侵襲的影響 LINC00665過(guò)表達(dá)組、miR-186-5p+LINC00665過(guò)表達(dá)組、對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（141.67±4.51）、（75.33±3.21）、（27.33±1.53）個(gè)，穿膜細(xì)胞數(shù)LINC00665過(guò)表達(dá)組＞miR-186-5p+LINC00665過(guò)表達(dá)組＞對(duì)照組（P均＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-186-5p對(duì)LINC00665過(guò)表達(dá)所致H1688細(xì)胞侵襲的影響（Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)）

3 討論

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA在調(diào)控基因組活性的多個(gè)方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用［11］，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA剪接、蛋白質(zhì)翻譯后修飾等［12］。LncRNA可以通過(guò)對(duì)組蛋白進(jìn)行修飾和染色體重構(gòu)等方式參與染色體結(jié)構(gòu)調(diào)控［13］，通過(guò)修飾編碼蛋白基因的啟動(dòng)子或介導(dǎo)啟動(dòng)子的去甲基化等途徑參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［14］，還可通過(guò)影響蛋白質(zhì)的磷酸化或泛素化參與蛋白質(zhì)活性調(diào)控等［15］。LncRNA與機(jī)體的發(fā)育和疾病密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)病中也具有重要作用。

LINC00665作為L(zhǎng)ncRNA的一員，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用。研究表明，LINC00665在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-9-5p/ATF1軸促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡［16］。在卵巢癌組織中，LINC00665表達(dá)上調(diào)與患者預(yù)后不良有關(guān)；LINC00665可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-34a-5p減弱其對(duì)下游基因E2F3的抑制作用，從而促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LINC00665在SCLC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而且LINC00665過(guò)表達(dá)可促進(jìn)SCLC細(xì)胞的增殖和侵襲。這提示LINC00665在SCLC中起促癌作用，但具體作用機(jī)制尚不清楚。

miRNA在基因表達(dá)調(diào)控方面起重要作用。其異常表達(dá)可以引起多種疾病，包括腫瘤、心血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。miR-186-5p作為一種miRNA，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤（NB）中可靶向作用于Eg5的3"端非翻譯區(qū)降低Eg5表達(dá)，從而抑制NB細(xì)胞增殖［18］。在胃癌組織和細(xì)胞中miR-186-5p低表達(dá)，并可通過(guò)調(diào)控NEK2抑制細(xì)胞周期并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［19］。研究表明，miR-186-5p過(guò)表達(dá)可抑制HCC細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-186-5p表達(dá)與HCC細(xì)胞中的LINC00665或MAP4K3（具有與miR-186-5p的結(jié)合位點(diǎn)）呈負(fù)相關(guān)，即LINC00665通過(guò)miR-186-5p/MAP4K3軸抑制了HCC細(xì)胞的凋亡和自噬［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LINC00665過(guò)表達(dá)時(shí)，可降低SCLC中miR-186-5p表達(dá)，而miR-186-5p過(guò)表達(dá)則減弱LINC00665對(duì)SCLC細(xì)胞增殖和侵襲的促進(jìn)作用，即LINC00665可促進(jìn)SCLC細(xì)胞增殖、侵襲，該作用與其調(diào)控miR-186-5p表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LINC00665在SCLC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可通過(guò)負(fù)向調(diào)控miR-186-5p促進(jìn)SCLC細(xì)胞的增殖和侵襲。這將為臨床上尋找SCLC潛在的治療靶點(diǎn)提供一定的參考依據(jù)，有利于提高SCLC患者的治療效果。但是本研究?jī)H分析了二者在H1688細(xì)胞中的作用，后續(xù)將在腫瘤及癌旁組織進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。