李娟，劉桂榮，秦顥誠，武俊

1連云港市第二人民醫(yī)院，江蘇連云港 222000；2連云港市第一人民醫(yī)院；3大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院

目前，乳腺癌的治療方式以手術(shù)為主、放化療等為輔；然而，傳統(tǒng)抗腫瘤藥物血藥濃度不穩(wěn)定，半衰期短，不良反應(yīng)大，嚴(yán)重影響了其療效。隨著納米技術(shù)研究的深入，靶向給藥納米粒系統(tǒng)在改善抗腫瘤藥物不良反應(yīng)和耐藥性等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。納米粒通過高通透、高滯留效應(yīng)實(shí)現(xiàn)腫瘤被動靶向［1］，同時在納米粒表面修飾的靶向分子可以使其獲得主動靶向能力，內(nèi)部包載顯像劑及藥物可實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期影像學(xué)診斷及可視化治療。研究顯示，αvβ3整合素受體在某些侵襲性腫瘤如乳腺癌、黑色素瘤等呈過表達(dá)，具有精氨酸—甘氨酸—天門冬氨酸（RGD）肽段的RGDfK可與其特異性結(jié)合，提高納米粒的腫瘤主動靶向能力［2-3］。2018年7月—2020年6月，我們選用普通造影劑聚乳酸—羥基乙酸（PLGA）為成膜材料，采用雙乳化法及碳二亞胺法制備攜RGD靶向肽的載紫杉醇（PTX）超聲造影劑，觀察其體外對乳腺癌細(xì)胞的靶向能力、細(xì)胞殺傷效率及超聲造影情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 羥基端乳酸—羥基乙酸共聚物（PLGA-COOH，聚合比例75∶25）；PTX（上海源葉有限公司）；MES緩沖液（pH 5.5/8.0）、偶聯(lián)活化劑（EDC、NHS）及熒光染料DiⅠ、DAPI（Sigma，美國）；FITC標(biāo)記的RGDfK肽（武漢博士德生物工程有限公司）；人乳腺癌細(xì)胞MBA-MD-231（蚌埠醫(yī)學(xué)院病理教研室提供）；VCY-500超聲波處理器（上海標(biāo)本模型廠）；M S2000激光粒度分析儀（Malvern，美國）；LSM 900激光共聚焦顯微鏡（ZEISS，德國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靶向載藥造影劑PTX-PLGA-RGDfK的制備 將100 mg PLGA-COOH及10 mg PTX完全溶于2 mL二氯甲烷中，另加入0.2 mL雙蒸水，冰浴下聲振120 s（100 W，on 4 s/off 2 s）；加入4%PVA溶液5 mL，再次聲振90 s（75 W，on 4 s/off 2 s）；加入2%異丙醇溶液20 mL，室溫下攪拌3 h得載藥造影劑（PTX-PLGA）。將10 mg PTX-PLGA溶解于適量MES緩沖液（pH 5.5）中，加入適量偶聯(lián)活化劑EDC和NHS（摩爾濃度比為2∶5），振蕩孵育0.5 h；多次離心洗滌后，重懸于MES緩沖液（pH 8.0）中；加入適量FITC-RGDfK（RGDfK肽終濃度為1.0 mmol/L），冰浴下振蕩孵育1～2 h；雙蒸水多次離心洗滌，冷凍干燥，充入氟碳?xì)怏w得PTX-PLGA-RGDfK凍干粉。

1.2.2 PTX-PLGA-RGDfK一般性質(zhì)檢測 光鏡下觀察PTX-PLGA-RGDfK的形態(tài)，馬爾文激光粒徑儀檢測其粒徑分布及表面電位，高效液相色譜法測定PTX在PTX-PLGA-RGDfK及體外緩釋液中的含量。檢測條件：流動相甲醇與水比例為77∶23，波長227nm。樣品處理方法：稱取10 mg PTX-PLGA-RGDfK充分溶解于0.5 mL二甲亞砜中，以2.5 mL甲醇溶解萃取紫杉醇，經(jīng)0.22μm PVDF膜過濾，取20μL進(jìn)樣。包封率及載藥量計算：包封率=（Cm/Ct）×100%；載藥量=（Cm/WT）×100%；其中Cm為載入PTX-PLGA-RGDfK中PTX的質(zhì)量；Ct為原料內(nèi)PTX的用量，WT為PLGA-COOH的用量。

1.2.3 PTX-PLGA-RGDfK體外釋藥能力觀察 將10 mg PTX-PLGA-RGDfK充分溶解于2 mL PBS緩沖液（pH 7.4），轉(zhuǎn)移至透析袋（截留分子量為8 kD）后浸沒于150 mL緩釋介質(zhì)中，于37℃120 r/min恒溫振蕩器內(nèi)持續(xù)震蕩；分別于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、48、72 h取樣1 mL，并補(bǔ)加同體積緩釋介質(zhì)，經(jīng)0.22μm PVDF膜過濾；取20μL進(jìn)樣，計算PTX-PLGA-RGDfK的藥物累積釋放百分率，并繪制釋放時間曲線。

1.2.4 PTX-PLGA-RGDfK表面FITC-RGDfK連接及體外乳腺癌細(xì)胞靶向情況觀察 聯(lián)合使用激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測PTX-PLGA-RGDfK表面FITC-RGDfK的連接情況，激光共聚焦顯微鏡下經(jīng)DiⅠ染色的PTX-PLGA-RGDfK造影劑表現(xiàn)為紅色熒光、FITC-RGDfK發(fā)出綠色熒光、圖像疊加后呈黃色熒光，流式細(xì)胞儀測算靶向造影劑表面FITC-RGDfK的平均結(jié)合率。另取適量對數(shù)生長期的MBA-MD-231細(xì)胞接種6孔板，分為A、B兩組；待細(xì)胞全部貼壁并生長到適量密度，A、B組分別加入經(jīng)DiI處理的PTX-PLGA及PTX-PLGA-RGDfK，繼續(xù)孵育2 h；每孔加入適量4%多聚甲醛固定液固定15 min，再以適量DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，于激光共聚焦顯微鏡下觀察體外細(xì)胞靶向情況。DAPI染色的細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)光熒光，如細(xì)胞周圍可見大量紅色熒光靶向造影劑則表示靶向成功。

1.2.5 PTX-PLGA-RGDfK體外乳腺癌細(xì)胞毒性觀察 將處于對數(shù)生長期的MBA-MD-231細(xì)胞以5×103/孔接種96孔板，恒溫培養(yǎng)箱中繼孵育24 h。將上述細(xì)胞分為4組，每組分別設(shè)置8個平行復(fù)孔；對照組不作處理，PLGA組、PTX-PLGA組、PTX-PLGARGDfK組分別加入PLGA、PTX-PLGA、PTX-PLGARGDfK，調(diào)整其納米粒濃度分別為0.5、1.5、2.5、5.0 mg/mL，各組孵育2 h；PBS沖洗5次，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞存活率。設(shè)定對照組細(xì)胞生存率為100%，計算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性率。細(xì)胞活性率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.6 體外顯影情況觀察 將PTX-PLGA-RGDfK充分溶于雙蒸水，調(diào)整濃度至3 mg/mL；取2 mL于百勝M(fèi)ylab 90彩色多普勒超聲診斷儀造影模式下觀察造影劑體外顯影情況，以脫氣水作為對照。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTX-PLGA-RGDfK的一般性質(zhì) PTX-PLGARGDfK水溶性較好，大小較均一（見圖1A），粒徑為（326.24±56.63）nm（見 圖1B），表 面 電 位為-11.4 mV（見圖1C）。PTX的包封率為82.10%±2.12%，載藥量為8.21%±0.21%。

2.2 PTX-PLGA-RGDfK體外釋藥能力 PTXPLGA-RGDfK在最初的12 h內(nèi)藥物突釋，釋放量達(dá)46.59%±1.83%；隨后出現(xiàn)平穩(wěn)的緩慢釋放，72 h后釋放率達(dá)73.26%±1.98%。見OSID碼圖1。

2.3 PTX-PLGA-RGDfK表面FITC-RGDfK連接及體外乳腺癌細(xì)胞靶向情況 流式細(xì)胞儀檢測顯示，靶向造影劑表面FITC-RGDfK結(jié)合率達(dá)95.28%±0.37%（見OSID碼圖2）。激光共聚焦顯微鏡下，兩組DAPI染色的乳腺癌細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)光熒光，A組乳腺癌細(xì)胞周圍僅見極少紅色熒光非靶向造影劑（OSID碼圖3A），而B組乳腺癌細(xì)胞周圍可見大量紅色熒光靶向造影劑（OSID碼圖3B）。

圖1 PTX-PLGA-RGDf K的一般性質(zhì)

2.4 PTX-PLGA-RGDfK體外乳腺癌細(xì)胞毒性 與PLGA組同濃度比較，PTX-PLGA組、PTX-PLGARGDfK組細(xì)胞存活率降低，且PTX-PLGA-RGDfK組低于PTX-PLGA組（P均＜0.05）。見圖2。

圖2 不同造影劑不同濃度下對乳腺癌細(xì)胞活性的影響（CCK-8法）

2.5 PTX-PLGA-RGDfK體外顯影情況 PTXPLGA-RGDfK體外顯影成像效果較好，回聲均勻細(xì)膩；脫氣水對照無回聲，無增強(qiáng)顯影。見OSID碼圖4。

3 討論

目前，臨床常用超聲造影劑粒徑都在1μm以上，屬于血池顯像劑，無法穿過血管內(nèi)皮間隙滲透至腫瘤組織內(nèi)，存在一定的局限性。納米載藥系統(tǒng)是指粒徑在10～1 000 nm的內(nèi)部或表面包封或修飾藥物的固態(tài)膠體顆粒［4］，由納米尺度引起的高通透強(qiáng)滯留效應(yīng)簡稱EPR效應(yīng)，可使大分子類物質(zhì)和脂質(zhì)顆粒更易進(jìn)入血管豐富、血管壁間隙較寬、結(jié)構(gòu)完整性差的實(shí)體腫瘤內(nèi)并長期蓄積，有效克服了傳統(tǒng)化療藥物在腫瘤部位低蓄積、生物利用度差、不良反應(yīng)大等缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)納米粒的腫瘤被動靶向［5-6］。盡管如此，腫瘤的異質(zhì)性和多藥耐藥等使被動靶向效果仍差強(qiáng)人意。因此，在納米粒表面修飾靶向分子如抗體、肽、小分子等使納米粒獲得主動靶向能力，再裝載對比顯像劑及藥物，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷及可視化的靶向治療，或可成為新的研究方向。

PTX可促進(jìn)微管聚合并穩(wěn)定已聚合的微管［7］，是乳腺癌化療的主要藥物之一；但該藥對腫瘤細(xì)胞并無特異性，且使用時需有機(jī)溶劑溶解，進(jìn)一步增加了其不良反應(yīng)；以納米制劑包裹PTX，可增加藥物在腫瘤內(nèi)的濃度，提高對腫瘤組織的靶向性，減少不良反應(yīng)［8-9］。PLGA是一種可降解的高分子有機(jī)化合物，其生物相容性好、穩(wěn)定性高且無毒，具有包裹藥物和免疫抗原的能力，已被諸多學(xué)者用作藥物和基因遞送的載體材料［10-11］。PLGA包載PTX形成納米顆粒，能保護(hù)其生物活性，延長藥物在體內(nèi)的半衰期，這對于長期用藥者具有重要的臨床意義［12］。本研究中制備的靶向載藥造影劑粒徑為（326.24±56.63）nm，可有效穿過腫瘤血管內(nèi)皮間隙，彌散至腫瘤組織間隙。該造影劑藥物的包封率為82.10%±2.12%，載藥量為8.21%±0.21%。體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示，在最初的12 h藥物的突釋作用較強(qiáng)，達(dá)到46.59%±1.83%，其原因主要為這部分藥物是黏附于造影劑表面或未被嚴(yán)密包裹進(jìn)去的PTX突釋引起的；12 h后藥物釋放速率減慢，趨于平緩，72 h后藥物釋放量達(dá)73.26%±1.98%。

整合素是一種由兩個異二聚體非共價連接的跨膜糖蛋白，可介導(dǎo)細(xì)胞—細(xì)胞和細(xì)胞—細(xì)胞外基質(zhì)的相互黏連和雙向信號傳遞。迄今已發(fā)現(xiàn)24種整合素，其中整合素αvβ3的研究最廣泛［13-14］，它可特異性識別RGD三肽序列。研究表明，αvβ3整合素受體在乳腺癌、骨肉瘤和惡性黑色素瘤中過表達(dá)［2-3］，可通過具有RGD肽段的RGDfK作為腫瘤靶向肽，與αvβ3整合素受體特異性結(jié)合，提高納米粒的腫瘤靶向性。本研究成功制備出攜RGDfK的載PTX造影劑，該造影劑可特異性結(jié)合到人乳腺癌細(xì)胞MBA-MD-231表面，其細(xì)胞毒性高于單純載藥造影劑，抗腫瘤效應(yīng)得到大幅度提升；并且，該造影劑體外顯影實(shí)驗(yàn)可見超聲造影模式下，造影劑成像效果較好，內(nèi)部回聲均勻細(xì)膩。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了攜RGDfK載PTX靶向超聲造影劑，該造影劑藥物包封率及載藥量較高，且具有一定的藥物緩釋效應(yīng)及較好的乳腺癌細(xì)胞靶向能力；同時，其體外抗腫瘤細(xì)胞效應(yīng)明顯，體外顯影效果較好，為進(jìn)一步開展體內(nèi)靶向抗腫瘤效應(yīng)及腫瘤顯影研究提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。