楊針，張?jiān)皆溃瑥埼闹?，盧鵬

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院，海南三亞 572000

肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球居第5位，病死率居第2位［1-2］。多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)展至晚期，失去了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，而通常的治療手段如射頻、動(dòng)脈栓塞等總體療效仍未能令人滿意［3］。近年來(lái)，以RNA干擾（RNAi）技術(shù)為代表的基因治療在腫瘤治療方面取得較大進(jìn)步，其通過(guò)選擇性靶向干擾特定蛋白的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，已成為有希望的腫瘤治療策略之一［4］。c-Met是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的受體，在肝癌中高表達(dá)，與肝癌的增殖、分化和血管生成相關(guān)［5-6］，被認(rèn)為是肝癌中有希望的潛在基因治療分子靶點(diǎn)。雖然RNAi在抗癌治療中應(yīng)用潛力很強(qiáng)，但其在體內(nèi)半衰期短、缺乏靶細(xì)胞特異性且穿過(guò)細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)差［7-8］，應(yīng)用受到限制。因此，必須選擇一種可穩(wěn)定攜帶小干擾RNA（siRNA）同時(shí)具有靶向運(yùn)輸作用的載體。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，醫(yī)用納米技術(shù)應(yīng)用于腫瘤治療中，已成為新的研究熱點(diǎn)。因此，本研究的目的是構(gòu)建一種新穎可行的siRNA運(yùn)載體，能將siRNA遞送到肝癌組織并能發(fā)揮RNAi作用抑制腫瘤生長(zhǎng)。磁性納米顆粒（SPIO）是靶向治療的有效載體，具有獨(dú)特的磁導(dǎo)向性和表面效應(yīng)，可通過(guò)特異性修飾將藥物選擇性地定位到病灶部位，從而提高藥物療效，被廣泛用于藥物的靶向運(yùn)輸。通常siRNA與磁性納米顆粒均為負(fù)電荷，如何將二者有效結(jié)合成為潛在難點(diǎn)。聚乙烯亞胺（PEI）是一種人工合成的陽(yáng)離子，帶有大量正電荷，通過(guò)正負(fù)電荷的相互作用與siRNA、SPIO結(jié)合，并可攜帶siRNA順利通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)中，從而發(fā)揮siRNA的RNAi作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖（Gal）修飾的SPIO可與肝癌細(xì)胞表面特異性表達(dá)的去唾液酸糖蛋白受體識(shí)別［10］，從而使SPIO被肝癌細(xì)胞特異性識(shí)別。2019年6月—2020年9月，我們以Gal、PEI修飾的SPIO（Gal-PEI-SPIO）［11］為載體，觀察其介導(dǎo)的c-Met siRNA的抗肝癌細(xì)胞效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 肝癌細(xì)胞系MHCC-97H（美國(guó)ATCC公司），細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；TRIzol RNA分離試劑（美國(guó)Invitrogen公司），SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE公司），氯仿，PCR試劑盒（Prime ScriptTMKit Reagent Kit with gDNA Eraser），CCK-8試劑（南京碧云天公司），共聚焦激光掃描顯微（CLSM，日本Olympus公司），凝膠成像儀（Chemi Doc MP System，美國(guó)BioRad公司）；c-Met siRNA的序列為5"-CCACGTGAACGCTACTTAT-3"，NCsiRNA的序列號(hào)siN05815122147，均由廣州銳博公司合成。

1.2 Gal-PEI-SPIO與siRNA的結(jié)合效率觀察 采用瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。將Gal-PEI-SPIO與siRNA按SPIO與siRNA不同質(zhì)量比混合，室溫孵育30 min以形成Gal-PEI-SPIO/siRNA復(fù)合物。通過(guò)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Gal-PEI-SPIO與siRNA的結(jié)合，若在瓊脂糖凝膠的圖像中缺少條帶，表明siRNA與Gal-PEI-SPIO緊密結(jié)合。

1.3 Gal-PEI-SPIO對(duì)MHCC-97H的細(xì)胞毒性檢測(cè) 采用CCK-8法。將MHCC-97H細(xì)胞接種96孔板并培養(yǎng)24 h，將Gal-PEI-SPIO/NCsiRNA按不同濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞；培養(yǎng)24 h后用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞存活率，從而評(píng)價(jià)不同濃度Gal-PEI-SPIO與siRNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性。

1.4 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA納米復(fù)合物在MHCC-97H細(xì)胞中的沉默效率觀察

1.4.1 c-Met mRNA檢測(cè) 采用q-PCR法。將MHCC-97H細(xì)胞以2×105/孔接種6孔板，每孔中加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后用等量無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基沖洗替換培養(yǎng)基，將含Gal-PEI-SPIO與c-Met siRNA/NCsiRNA納米復(fù)合物分別加入不同的孔中，37℃孵育6 h。然后用含血清培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，將細(xì)胞在37℃孵育24 h。用TRIzol試劑充分裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞的總RNA；按照Prime ScriptTMRT試劑盒說(shuō)明將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用qPCR定量分析結(jié)果。c-Met引物序列：上游為5"-ATCTCGGAGCCACAAACTA‐CA-3"，下游為5"-CAGTCCCGACAAGGTAAACAAT-3"；內(nèi)參β-actin引物序列：上游為5"-CATCCGTA‐AAGACCTCTATGCCAAC-3"，下游為5"-ATGGAGC‐CACCGATCCACA-3"。

1.4.2 c-Met蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。Gal-PEI-SPIO與c-Met siRNA/NCsiRNA納米復(fù)合物按照“1.4.1”轉(zhuǎn)染MHCC-97H細(xì)胞48 h，用PBS洗滌干凈后放置冰上；加入蛋白裂解液，使蛋白裂解液與細(xì)胞層面充分接觸；加入5×loading buffer，混勻后煮沸10 min，然后-20℃保存。通過(guò)8%SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)樣品，將含有目的條帶蛋白的PVDF膜分別與小鼠抗β-actin抗體（1∶2 000）和小鼠抗c-Met抗體（1∶1 000）在4℃搖床過(guò)夜孵育。吸去一抗溶液后用TBST溶液充分洗滌，將膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）在搖床上室溫孵育1 h。使用發(fā)光液檢測(cè)試劑檢測(cè)PVDF膜上的蛋白信號(hào)強(qiáng)度，并用Imagine Lab進(jìn)行圖像分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶吸光度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA納米復(fù)合物影響MHCC-97H細(xì)胞遷移和侵襲能力的觀察

1.5.1 遷移實(shí)驗(yàn) 采用Transwell小室。Gal-PEISPIO與c-Met siRNA/NC siRNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染MHCC-97H細(xì)胞，48 h后用胰蛋白酶消化并離心收集細(xì)胞；用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀調(diào)整細(xì)胞密度2×105/mL。將Transwell小室放入24孔板中，在下室中加入500μL含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，上室中加入Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA或NC siRNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染后不含血清的MHCC-97H細(xì)胞懸液150μL。培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，晾干后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min。在400×顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，取均值即為遷移細(xì)胞數(shù)。

1.5.2 侵襲實(shí)驗(yàn) 采用包被有基質(zhì)膠的Transwell小室，其他步驟同體外遷移實(shí)驗(yàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，數(shù)據(jù)比較行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gal-PEI-SPIO與siRNA的結(jié)合效率 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)顯示，在Gal-PEI-SPIO和siRNA以SIPO、siRNA質(zhì)量比≥4∶1時(shí)，兩者可以緊密結(jié)合。見(jiàn)圖1。

圖1 Gal-PEI-SPIO與siRNA的結(jié)合情況（瓊脂糖凝膠電泳）

2.2 Gal-PEI-SPIO對(duì)MHCC-97H的細(xì)胞毒性 當(dāng)在Gal-PEI-SPIO和siRNA以SIPO、siRNA質(zhì)量比≥4∶1時(shí)，MHCC-97H細(xì)胞存活率迅速降低，表明細(xì)胞毒性大。所以，我們選擇了SPIO、siRNA質(zhì)量比為4∶1作為實(shí)驗(yàn)的最終比例。見(jiàn)圖2。

2.3 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA納米復(fù)合物在MHCC-97H細(xì)胞中的沉默效率 轉(zhuǎn)染Gal-PEISPIO/c-Met siRNA納米復(fù)合物的MHCC-97H細(xì)胞中c-Met mRNA及蛋白表達(dá)量分別為0.625±0.047、0.315±0.015，均低于轉(zhuǎn)染Gal-PEI-SPIO/NCsiRNA納米復(fù)合物MHCC-97H細(xì)胞的1.092±0.058、1±0.082（P均＜0.01）。

圖2 Gal-PEI-SPIO納米載體對(duì)MHCC-97H細(xì)胞存活率的影響（CCK-8法）

2.4 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA納米復(fù)合物對(duì)MHCC-97H細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 轉(zhuǎn)染Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA納米復(fù)合物的MHCC-97H細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞分別為（50.29±6.21）、（77.00±5.33）個(gè)，均低于轉(zhuǎn)染Gal-PEI-SPIO/NC siRNA納米復(fù)合物MHCC-97H細(xì)胞的（75.94±9.54）、（101.41±4.36）個(gè)（P均＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA納米復(fù)合物對(duì)MHCC-97H細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

3 討論

目前，以RNAi為代表的基因治療技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療中，成為有希望的治療策略之一［12］；但受限于siRNA在體內(nèi)半衰期短、缺乏靶細(xì)胞特異性以及穿過(guò)細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)差等缺點(diǎn)，必須要選擇一種可穩(wěn)定攜帶siRNA同時(shí)具有靶向運(yùn)輸作用的載體。醫(yī)用納米技術(shù)應(yīng)用于腫瘤治療已成為研究熱點(diǎn)，同時(shí)為RNAi治療帶來(lái)希望。在本研究中，我們研究了一種新型的siRNA納米運(yùn)載體。該運(yùn)載體是基于Gal、PEI修飾的SPIO，可通過(guò)Gal特異性識(shí)別肝癌表面表達(dá)的去唾液酸糖蛋白受體，使得SPIO特異性地被肝癌細(xì)胞識(shí)別，從而將siRNA靶向作用到肝癌部位，降低對(duì)正常組織的損傷作用；同時(shí)能攜帶并保護(hù)siRNA順利通過(guò)細(xì)胞膜，將siRNA遞送到肝癌細(xì)胞胞質(zhì)中，從而發(fā)揮siRNA的RNAi作用來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)SPIO與siRNA質(zhì)量比≥4∶1時(shí)，siRNA可完全與納米載體結(jié)合。同時(shí)，細(xì)胞活性檢測(cè)顯示，其質(zhì)量比≥4∶1時(shí)細(xì)胞活性顯著降低。因此，以SPIO與siRNA質(zhì)量比4∶1作為本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染比例。

c-Met是細(xì)胞生長(zhǎng)因子的受體，其在肝癌組織中高表達(dá)，與肝癌的增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成等因素密切相關(guān)［13-14］。因此，c-Met基因也被認(rèn)為是肝癌中有希望的基因治療潛在分子靶點(diǎn)。本課題設(shè)計(jì)了針對(duì)c-Met的siRNA，并通過(guò)q-PCR、Western blotting法檢測(cè)Gal-PEI-SPIO能否有效攜帶c-Met siRNA進(jìn)入MHCC-97H細(xì)胞中發(fā)揮沉默效果；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Gal-PEI-SPIO可有效攜帶c-Met siRNA進(jìn)入細(xì)胞，可顯著降低c-Met在肝癌細(xì)胞中的基因水平，并能在蛋白水平抑制c-Met形成。這充分說(shuō)明了該納米載體可攜帶c-Met siRNA進(jìn)入腫瘤細(xì)胞中，并發(fā)揮RNAi作用。此外，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA復(fù)合物可抑制肝癌細(xì)胞遷移、侵襲的能力。由此可見(jiàn)，我們研制的Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA復(fù)合物在體外對(duì)MHCC-97H細(xì)胞有顯著抗腫瘤活性，為肝癌的治療提供了新的靶向策略，并為其在體內(nèi)抗腫瘤活性的研究提供了重要基礎(chǔ)。