陳 泉，黃仁軍，馮小華，羊 練，何錦輝

（1.重慶三峽農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶萬(wàn)州 404155；2.重慶市萬(wàn)州區(qū)植物保護(hù)與果樹(shù)技術(shù)推廣站，重慶萬(wàn)州 404155）

塔羅科血橙新系（C.sinensis‘Tarocco’）是20世紀(jì)60 年代以來(lái)，依托農(nóng)業(yè)部柑橘948 項(xiàng)目、國(guó)家農(nóng)業(yè)部八五重點(diǎn)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目等，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所牽頭，聯(lián)合相關(guān)單位，從意大利引入三峽庫(kù)區(qū)試種，后從其實(shí)生后代中篩選出一個(gè)優(yōu)良變異單株，并在川渝多地進(jìn)行了品種觀察和生態(tài)適應(yīng)性評(píng)價(jià)。四川富順、資中，重慶萬(wàn)州、長(zhǎng)壽等地海拔500 m以下的區(qū)域，年日照時(shí)數(shù)達(dá)到1 300 h，最冷月氣溫6～8 ℃，少霜凍，2—4月氣溫平穩(wěn)，降雨量少，非常適宜塔羅科血橙著色和越冬，表現(xiàn)出了良好的優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)特性。因此，川渝兩地的塔羅科血橙逐步發(fā)展壯大，成為我國(guó)塔羅科血橙主產(chǎn)區(qū)，種植規(guī)模達(dá)5 萬(wàn)公頃，形成獨(dú)具特色的地方農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)［1］。

在我國(guó)，炭疽病是柑橘發(fā)生最普遍的病害之一，在所有柑橘產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，發(fā)病重的果園病株率在90%以上，冬、春落葉率40%～50%，有的果園甚至絕收［2］。病菌可為害柑橘各個(gè)部位，具有弱寄生性和潛伏侵染特性，在貯藏期還可繼續(xù)發(fā)病引起爛果［3-4］。柑橘炭疽病可進(jìn)行多次再侵染，常造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［5-7］。

通常，國(guó)內(nèi)對(duì)柑橘炭疽病的防治常常與輪斑病、褐斑病、黑斑病、青霉病、綠霉病防治等結(jié)合起來(lái)，很少將柑橘炭疽病單獨(dú)作為防治指標(biāo)。柑橘炭疽菌的主要寄主之一是甜橙類［4］，而塔羅科血橙新系就屬于甜橙類，是晚熟柑橘中的一類重要寄主。幾乎所有塔羅科血橙新系每年都要環(huán)割修剪2～3次，越來(lái)越多的新品種高換等造成的傷口，易引發(fā)侵染危害［8］。近年來(lái)，塔羅科血橙新系主產(chǎn)區(qū)炭疽病發(fā)生率有上升趨勢(shì)，且現(xiàn)有防治措施的防效低下，常常導(dǎo)致嚴(yán)重落果和采后貯藏病害，從而帶來(lái)直接經(jīng)濟(jì)損失。本研究對(duì)川渝地區(qū)塔羅科血橙炭疽病發(fā)病情況進(jìn)行了調(diào)查，并開(kāi)展了田間藥效試驗(yàn)，以期為掌握柑橘炭疽病的發(fā)生情況和防治技術(shù)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 炭疽樣品

2019—2021 年，在重慶長(zhǎng)壽、開(kāi)州、奉節(jié)、云陽(yáng)、涪陵，四川資中、富順、內(nèi)江等地采集疑似柑橘炭疽病癥狀的樣品（果實(shí)、枝條、葉片），共收集樣品239份。

1.1.2 PDA培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，煮沸后定容至1 L，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 供試藥劑

25%吡唑醚菌酯懸浮劑（山東康喬生物科技有限公司），97%礦物油［上海滬聯(lián)生物藥業(yè)（夏邑）股份有限公司］，80%代森錳鋅可濕性粉劑（利民化工股份有限公司），25%多菌靈可濕性粉劑（江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司），25%咪鮮胺乳油（山東華陽(yáng)農(nóng)藥化工集團(tuán)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原分離鑒定

菌株的分離采用組織分離方法，參考《植病研究法》（方中達(dá)編著，1979），單孢純化后，接種到PDA培養(yǎng)基斜面中，25 ℃培養(yǎng)長(zhǎng)出菌落后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 直接PCR分子檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)用通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTATGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′），采用直接PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。直接PCR 反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix15ul（2×H-TECH SYBR qPCR Mix videgene Cat.GDQ3003），上下游引物各0.5 μL，ddH2O 14 μL，菌絲少量。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃3 min；95 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s；72 ℃延伸20 s，44 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增出條帶后，用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)，核酸染料為低毒的Gel Red 染料。

1.2.3 ITS序列比對(duì)

將陽(yáng)性菌株的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物公司單向測(cè)序，對(duì)測(cè)得序列刪除引物序列，在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行Blast 檢索，比對(duì)菌株是否為炭疽菌。

1.2.4 致病性鑒定

選取健康的塔羅科血橙新系果實(shí)，用75%乙醇表面消毒5 min，無(wú)菌水清洗2～3 次，然后用無(wú)菌紗布擦干。針刺果實(shí)腰部果皮10針，在針刺處接種菌株菌絲塊，25 ℃下保濕培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。每菌株重復(fù)3次，以針刺果實(shí)不接種菌絲塊為對(duì)照。

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算發(fā)病率。

發(fā)病率（%）＝檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品數(shù)/檢測(cè)樣品總數(shù)×100

1.2.5 田間藥效試驗(yàn)

2019—2020 年，選擇萬(wàn)州區(qū)甘寧鎮(zhèn)南橋村炭疽病發(fā)病嚴(yán)重的天奧果園開(kāi)展田間藥效試驗(yàn)，樹(shù)齡10年，長(zhǎng)勢(shì)一致。試驗(yàn)設(shè)置6 個(gè)處理（見(jiàn)表1），每個(gè)處理重復(fù)3 次，共計(jì)18 個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)5 株柑橘樹(shù)，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)間及試驗(yàn)田四周設(shè)有保護(hù)行。采用電動(dòng)噴霧器噴霧，先噴清水對(duì)照，然后噴試驗(yàn)藥劑。噴施藥劑時(shí)按照濃度由低到高的順序進(jìn)行，換藥前清洗干凈噴霧器。2019 年6 月12 日、6 月28日、7 月15 日各噴藥1 次，采前20 d 再噴1 次，其他管理正常進(jìn)行。在2019 年8 月2 日、2020 年1 月22 日調(diào)查防效，以及采后10 d、采后20 d、采后30 d 分別調(diào)查果實(shí)發(fā)病情況，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS16.0 軟件分析。每樹(shù)分東南西北4 個(gè)方位，隨機(jī)調(diào)查2 個(gè)枝條的全部葉片及5 個(gè)果實(shí)，調(diào)查葉片和果實(shí)上病斑情況，計(jì)算病情指數(shù)。

表1 塔羅科血橙新系炭疽病田間藥劑篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)

病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)，無(wú)??；1 級(jí)，每葉（果）1～5 個(gè)病斑或每葉（果）病斑面積占葉（果）面積5%以下；3級(jí)，每葉（果）6～10個(gè)病斑或每葉（果）病斑面積占葉（果）面積6%～10%；5 級(jí)，每葉（果）11～15 個(gè)病斑或每葉（果）病斑面積占葉（果）面積11%～25%；7 級(jí)，每葉（果）16～20 個(gè)病斑或每葉（果）病斑面積占葉（果）面積26%～50%；9級(jí)，每葉（果）21個(gè)病斑以上或每葉（果）病斑面積占葉（果）面積51%以上。

病情指數(shù)=∑［（各級(jí)病葉（果）數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）］/［調(diào)查總?cè)~（果）數(shù)×9］×100；

防治效果（%）=（空白對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/空白對(duì)照區(qū)病情指數(shù)×100。

1.2.6 采后發(fā)病情況調(diào)查

2月25日進(jìn)行采收，每樹(shù)分東南西北4個(gè)方位，隨機(jī)采收5個(gè)果實(shí)，每個(gè)處理共采收100個(gè)果實(shí)，每個(gè)處理的果實(shí)放入1個(gè)果框，室內(nèi)通風(fēng)陰涼處貯藏，分別在采后10 d、20 d、30 d調(diào)查果實(shí)發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 塔羅科血橙炭疽病發(fā)病情況調(diào)查

經(jīng)病原分離、PCR 檢測(cè)和致病性鑒定，在239 份樣品中，有151 份樣品感染了炭疽病，檢出率為63.18%，其中89份表現(xiàn)為強(qiáng)致病性，發(fā)病部位涉及葉片、枝梢、果實(shí)等，尤以葉片為重，主要表現(xiàn)為葉片尤其嫩葉上有圓形斑點(diǎn)，子實(shí)體輪紋狀排列，以及葉尖出現(xiàn)急性“V”字形失水枯萎等兩種癥狀；果實(shí)發(fā)病其次，一般表現(xiàn)為成熟期果實(shí)出現(xiàn)干疤、腐爛等癥狀。發(fā)病嚴(yán)重的會(huì)造成樹(shù)勢(shì)衰弱，成熟期病果多，落葉、落果嚴(yán)重，或引發(fā)貯藏期腐爛。

從采樣地點(diǎn)來(lái)看，塔羅科血橙主產(chǎn)區(qū)均表現(xiàn)出一定程度的發(fā)病，發(fā)病率最低的是重慶開(kāi)州的44.83%，最高為重慶萬(wàn)州的90.24%，這一結(jié)果也與筆者走訪調(diào)查結(jié)果相符。根據(jù)筆者走訪調(diào)查和室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果，重慶地區(qū)的柑橘炭疽病發(fā)病率顯著高于四川地區(qū)，可能與塔羅科血橙主產(chǎn)區(qū)縣處于三峽庫(kù)區(qū)地帶有關(guān)。萬(wàn)州區(qū)為塔羅科血橙主產(chǎn)區(qū)，近年來(lái)規(guī)?；l(fā)展迅速，種植水平較高，果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良，但因三峽庫(kù)區(qū)高溫高濕、寡日照的氣候條件，以及炭疽病弱寄生性和潛伏侵染特點(diǎn)，萬(wàn)州塔羅科血橙發(fā)病較其他地區(qū)嚴(yán)重。

表2 塔羅科血橙炭疽病發(fā)病情況調(diào)查

2.2 田間藥效試驗(yàn)

2.2.1 不同處理對(duì)塔羅科血橙炭疽病的防治效果

病情調(diào)查在2019 年8 月2 日和2020 年1 月22 日進(jìn)行，這時(shí)病情已經(jīng)穩(wěn)定，病斑癥狀明顯，較容易辨別區(qū)分。由調(diào)查數(shù)據(jù)可知（表4），試驗(yàn)所選用的藥劑對(duì)葉片和果實(shí)炭疽病均有防效，均表現(xiàn)為處理4＞處理1＞處理5＞處理2＞處理3。

在兩次調(diào)查中，處理4 用25%咪鮮胺乳油配合97%礦物油的防效最高，葉片防效達(dá)85.83%，果實(shí)防效85.03%，顯著高于其他處理；處理1 用25%苯醚甲環(huán)唑乳油配合97%礦物油的防效其次，葉片防效為78.81%，果實(shí)防效80.22%；兩次調(diào)查防效最低的都是處理3（80%代森錳鋅可濕性粉劑），分別為50.74%、54.90%。在8月2日進(jìn)行的葉片發(fā)病調(diào)查中，經(jīng)過(guò)三次施藥后，各處理炭疽病病情指數(shù)較對(duì)照有明顯降低，且處理間差異極顯著；在1 月22 日塔羅科血橙成熟期的調(diào)查中，處理2與處理5之間的防效差異不顯著。兩次調(diào)查中，處理4用處理5同樣的藥劑復(fù)配礦物油，防效均提升15%以上，處理1 的防效也較處理2 提升了15%以上，由此可見(jiàn)，柑橘炭疽病的防治，要選對(duì)藥劑，科學(xué)選用復(fù)配藥劑或助劑，殺菌效果更好。

表3 不同藥劑處理對(duì)炭疽病田間防效

2.2.2 果實(shí)采后發(fā)病情況

由表4 可知，采后常規(guī)貯藏10 d 后調(diào)查果實(shí)發(fā)病情況，各處理的病情指數(shù)均很低，對(duì)照也僅為20.1，防治效果均在50%以下。分析可能與塔羅科血橙新系果實(shí)降酸慢、成熟晚、耐貯藏等性能有關(guān)，采后10 d，整體發(fā)病較少，因而藥劑防治效果很難表現(xiàn)。隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，采后20 d 的調(diào)查結(jié)果顯示，各處理的防效與田間調(diào)查趨勢(shì)一致，表現(xiàn)為處理4＞處理1＞處理5＞處理2＞處理3；對(duì)照處理的病情指數(shù)迅速增加，各處理之間的防效差異極顯著，處理4 的防效最高，達(dá)82.65%，處理3 的防效最低，為58.59%。采后30 d 的調(diào)查結(jié)果顯示，處理4 的防效仍然最高，為82.47%，較處理5 高14%，二者差異極顯著；處理1 的防效較處理2高15%，二者差異極顯著。

表4 塔羅科血橙新系果實(shí)采后炭疽病發(fā)病情況

3 小結(jié)與討論

本研究開(kāi)展了四川、重慶兩地的塔羅科血橙炭疽病發(fā)生情況調(diào)查及防治藥劑篩選試驗(yàn)。我們對(duì)柑橘炭疽病的傳統(tǒng)認(rèn)知是發(fā)病普遍，危害嚴(yán)重，防治較易。針對(duì)塔羅科血橙這一優(yōu)勢(shì)特色產(chǎn)業(yè)，因種植區(qū)域有限，使得塔羅科血橙成為只能在我國(guó)川渝兩地規(guī)模發(fā)展的獨(dú)特產(chǎn)業(yè)，研究其炭疽病發(fā)病情況及防治方法很有必要。研究結(jié)果顯示，塔羅科血橙的炭疽病發(fā)生普遍，檢出率為63.18%，其中有89 份表現(xiàn)為強(qiáng)致病性；大部分調(diào)查區(qū)域的發(fā)病程度不嚴(yán)重，一般只引起部分葉片有葉枯（急性型）、葉斑（慢性型）等癥狀，沒(méi)有造成嚴(yán)重?fù)p失，鮮少有專門(mén)防治措施跟進(jìn)。研究結(jié)果還顯示，炭疽病在后期引起的采后貯藏病害不容小視，如不進(jìn)行藥劑防治，采后30 d 的病情指數(shù)可達(dá)71.3；25%咪鮮胺乳油配合97%礦物油噴灑4 次后，綜合防效可達(dá)85%以上，效果最好，對(duì)采后發(fā)病的防治效果也顯著，防效可達(dá)82.47%，可以有效減輕炭疽病造成的采后腐爛。綜合本研究結(jié)果，同一藥劑復(fù)配礦物油在適宜季節(jié)使用，可以有效提高防效15%左右，是較為理想的選擇，可以推廣使用。在生產(chǎn)實(shí)踐中還應(yīng)注意藥劑輪換使用，根據(jù)樹(shù)體情況進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充，配合好修剪、控水等措施，方能達(dá)到最理想的防控效果。