蔡 珊，紀(jì) 樸，張卓爾，張易華，黃亞梅，曹澳華，楊 芳

(1.安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000;2.陜西安康中學(xué),陜西 安康 725000;浙江農(nóng)林大學(xué) 理學(xué)院,浙江 杭州 311300)

鳳仙花(Impatiensbalsamina.L)，俗稱(chēng)指甲花，為鳳仙花科、鳳仙花屬，一年生草本花卉，花形似蝴蝶，花色多，自播繁殖[1]，生存力強(qiáng)，適應(yīng)性好，一般很少有病蟲(chóng)害，且鳳仙花具有祛風(fēng)除濕、活血定痛、抗菌、抗氧化防止蛋白損傷[2]等功效，故而在諸多方面有較大的應(yīng)用價(jià)值。

花青素(anthocyanin)又稱(chēng)花色素、花色苷，為酚類(lèi)化合物中類(lèi)黃酮物質(zhì)，普遍存在于植物花瓣、果實(shí)等部位，是一類(lèi)水溶性色素[3]，以C6-C3-C6為基本結(jié)構(gòu)骨架。因其結(jié)構(gòu)中的酚羥基，花青素苷具有一定的抗氧化活性：呂婉婉等[4]、郭麗等[5]、曹柏營(yíng)等[6]、杭園園等[7]、Sharma. G[8]研究表明花青素苷對(duì)自由基具有較高的清除能力，且王彥平等[9]、葛艷林[10]、李玲等[11]研究發(fā)現(xiàn)花青素苷對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基、OH自由基的清除能力均高于維生素C。花青素苷除抗氧化外還具有諸多生理功能：Erlei Wang[12]. Ashley M. Mudd[13]. Faeeukh Aqil[14]. Lilliana Primo da Silva[15]. Radha Munagala[16].研究表明花青素苷能夠抑制細(xì)胞增殖進(jìn)而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)并引發(fā)細(xì)胞凋亡；Jonfeng LI. Sharma. G[17]、鄧紅梅等[18]、孫倩怡等[19]、胡能兵[20]等研究表明花青素苷有著良好的抗炎抑菌效果；Bushra Hasan Khan[21]研究發(fā)現(xiàn)花青素苷對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝損傷具有一定的保護(hù)作用；Yoon-Mi Lee[22]研究發(fā)現(xiàn)花青素苷對(duì)肥胖誘導(dǎo)的代謝紊亂和炎癥有益。隨著科技的發(fā)展，花青素苷在醫(yī)藥、保健品等行業(yè)有著巨大的發(fā)展空間，故而對(duì)花青素苷的需求量也日益增大。

花青素苷的提取方法主要有兩大類(lèi)，一類(lèi)為傳統(tǒng)提取法，即有機(jī)溶劑浸提；另一類(lèi)是在傳統(tǒng)提取法的基礎(chǔ)上增加超聲、微波、超臨界等方法輔助，以增加提取率。筆者實(shí)驗(yàn)以超聲輔助法對(duì)鳳仙花花青素苷進(jìn)行提取，以單因素實(shí)驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化提取方案，并通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂純化，以DPPH自由基清除率、2,2'-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽{2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt， ABTS}自由基清除率以及還原力測(cè)定(鐵氰化鉀法)為指標(biāo)，對(duì)比鳳仙花花青素苷與維生素C的抗氧化性，為今后鳳仙花花青素苷的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

Sonicator4000超聲波破碎儀(美國(guó)QSonica公司)；V-1100D型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)；H-1850R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(上海利鑫堅(jiān)離心機(jī)有限公司)；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超聲輔助法提取鳳仙花花青素苷 準(zhǔn)確稱(chēng)取鳳仙花花粉1.0000 g于燒杯中，分別以超聲頻率(90、92、95、97、100Hz)、乙醇濃度(55%、60%、65%、70%、75%)、超聲溫度(35、37、40、43、45℃)為實(shí)驗(yàn)條件，pH=1的乙醇溶液為提取劑，超聲提取30 min(料液比為1∶20)，6 000 r·min-1離心10min，取上清液測(cè)OD530，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)；根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.2 鳳仙花花青素苷提取率的計(jì)算 花青素苷提取率(mg·g-1)=A*V*M*DF/(ε*d*m)[20]A為530 nm處測(cè)得的吸光度，V為提取液體積，DF為稀釋倍數(shù)，d為光路直徑，M為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量455.2，m為品質(zhì)量，ε為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)29600[20]。(絕大多數(shù)花青素苷中以矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷為主，故以矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷為對(duì)象計(jì)算。)

1.3.3 鳳仙花花青素苷的分離純化 大孔樹(shù)脂的活化、篩選：大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理見(jiàn)杭園園等[7]。篩選方法見(jiàn)李健等[23]，吸附率(%)=[A530nm(前)-A530nm(后)]/A530nm(前)×100，計(jì)算解吸率(%)=A530(解析)/A530(前)×100。比較選擇進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)，分析大孔樹(shù)脂的選擇結(jié)果。

柱層析法純化花青素苷：稱(chēng)取最佳樹(shù)脂100 g，預(yù)處理后裝柱。將提取液過(guò)該樹(shù)脂柱，花青素苷被吸附在樹(shù)脂上，待樹(shù)脂飽和后用蒸餾水沖洗，再用無(wú)水乙醇洗脫，收集洗脫液，測(cè)定吸光度。

1.3.4 鳳仙花花青素苷抗氧化活性試驗(yàn) DPPH自由基清除率的測(cè)定：具體操作見(jiàn)王彥平等[9]。

ABTS自由基清除率測(cè)定：具體操作見(jiàn)慈美琳等[24]。

還原力測(cè)定(鐵氰化鉀法)：具體操作方法見(jiàn)慈美琳等[24]。

習(xí)近平在慶祝中國(guó)共產(chǎn)黨成立95周年大會(huì)上指出：“在5000多年文明發(fā)展中孕育的中華優(yōu)秀傳統(tǒng)文化，在黨和人民偉大斗爭(zhēng)中孕育的革命文化和社會(huì)主義先進(jìn)文化，積淀著中華民族最深層的精神追求，代表著中華民族獨(dú)特的精神標(biāo)識(shí)。”[1]因而可以說(shuō)，由中華優(yōu)秀傳統(tǒng)文化、革命文化、社會(huì)主義先進(jìn)文化構(gòu)成的中國(guó)特色社會(huì)主義社會(huì)主義文化，就是中華民族的文化。中國(guó)特色社會(huì)主義文化自信，就是中華民族的文化自信，本質(zhì)上就是中華民族的民族自信。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2010、spss19.0軟件處理數(shù)據(jù)和作圖，極差分析法對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助法提取鳳仙花花青素苷

2.1.1 單因素結(jié)果分析 由圖1所得，隨著超聲頻率增大，花青素苷提取率逐漸升高，當(dāng)超聲頻率為100Hz時(shí)提取率最高。但在超聲頻率為95Hz時(shí)，提取率有所下降?？赡芤?yàn)槌暡ㄌ幚磉^(guò)程中空化泡沫劇烈壓縮和崩潰的瞬間，產(chǎn)生的熱氧化效應(yīng)造成花青素苷的損失，也可能是因?yàn)殡S著超聲波的增加，與蛋白質(zhì)等結(jié)合的花青素苷被提取出來(lái)，當(dāng)超聲波熱氧化效應(yīng)大于花青素苷提取率時(shí)，會(huì)顯示為花青素苷的提取了降低，而在締合的花青素苷提取率高于超聲波熱氧化效應(yīng)時(shí)，花青素苷的提取率又會(huì)升高[25]。

圖1 超聲頻率對(duì)鳳仙花花青素苷提取率影響

由圖2可知，隨乙醇濃度的升高，花青素苷提取率逐漸增加，乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)，花青素苷的提取率最高，隨后有略微下降趨勢(shì)，原因是花青素苷不穩(wěn)定，隨著乙醇濃度的增加，可能導(dǎo)致花青素苷結(jié)構(gòu)改變，降低花青素苷提取率[26]。

由圖3可知，隨提取溫度逐漸升高，花青素苷提取率逐漸增大，在43℃時(shí)達(dá)到最大，而后下降，分析其原因可能是花青素苷性質(zhì)不穩(wěn)定，高溫破壞花青素苷的結(jié)構(gòu)，使花青素苷發(fā)生降解，提取率降低[27,28]。

圖2 乙醇濃度對(duì)鳳仙花花青素苷提取率影響

圖3 提取溫度對(duì)鳳仙花花青素苷提取率影響

2.1.2 正交結(jié)果分析 正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，由表2、表3可知，各因素對(duì)花青素苷提取率影響大小為超聲頻率>乙醇濃度>提取溫度，且超聲頻率、乙醇濃度、提取溫度對(duì)花青素苷提率影響均為極顯著，優(yōu)化后的因素條件為超聲頻率100 Hz、乙醇濃度74%、提取溫度43℃。由于優(yōu)化后的因素條件不在表內(nèi)，需要進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果為5.403 9±0.330 8 mg·g-1，符合理論結(jié)果。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.2 鳳仙花花青素苷的分離純化

如圖4所示為靜態(tài)吸附下，大孔樹(shù)脂對(duì)鳳仙花花青素苷的吸附率與解析率的繪制曲線。(純化方法見(jiàn)1.3.3)相同條件下，NKA-II的吸附率最高，但解析率最低。HPD-400與ADS-7的解析率近似，ADS-7的吸附率顯然高于HPD-400，故選用ADS-7進(jìn)行花青素苷粗提液的純化，純化后的花青素苷濃度為4.4096 mg·g-1。

圖4 74%乙醇、超聲波輔助提取的花青素苷粗提液

2.3 鳳仙花花青素苷抗氧化活性試驗(yàn)

進(jìn)行抗氧化活性實(shí)驗(yàn)時(shí)，花青素苷與維生素C在比較時(shí)均在相同質(zhì)量濃度下進(jìn)行。

如圖5所示，鳳仙花花青素苷和維生素C在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基均有較好的清除能力。質(zhì)量濃度較小時(shí)，維生素C對(duì)DPPH自由基的清除率高于花青素苷，隨質(zhì)量濃度的增大，花青素苷對(duì)DPPH自由基的清除率高于維生素C，花青素苷的清除能力逐漸增大。

圖5 DPPH自由基清除率測(cè)定

如圖6所示，鳳仙花花青素苷和維生素C在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)ABTS自由基均有一定的清除能力。隨質(zhì)量濃度的增大，純花青素苷對(duì)ABTS自由基陽(yáng)離子的清除率高于維生素C對(duì)ABTS自由基陽(yáng)離子的清除率?；ㄇ嗨剀盏馁|(zhì)量濃度越大，清除ABTS自由基陽(yáng)離子的能力越好。

圖6 ABTS自由基清除率測(cè)定

如圖7所示。質(zhì)量濃度較小時(shí)，維生素C與花青素苷的吸光度相近，隨質(zhì)量濃度的增加，花青素苷的吸光度高于維生素C，由此可見(jiàn)花青素苷的還原能力高于維生素C。

圖7 還原力測(cè)定(鐵氰化鉀法)

3 結(jié)論與展望

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，優(yōu)化后的鳳仙花花青素苷超聲輔助提取因素條件為超聲頻率100Hz、乙醇濃度74%、提取溫度43℃；提取率為：5.4039±0.3308 mg·g-1；且高濃度的鳳仙花花青素苷對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力及其還原力均高于維生素C。故結(jié)果表明超聲輔助法對(duì)鳳仙花花青素苷的提取率較高，且鳳仙花花青素苷具有較高的抗氧化活性。

由于花青素苷苷易受影響分解，吳敏綜述表明天然花青素苷在酸性條件下比較穩(wěn)定，在光線(特別是紫外線)下易分解或氧化，避光保存可降低花青素苷降解率，低溫保存可延長(zhǎng)其半衰期，且金屬活性的副族金屬離子可與花青素苷反應(yīng)，影響其穩(wěn)定性[29]。故花青素苷在保存時(shí)應(yīng)確保其處于避光低溫條件下。

花青素苷的提取方法較多，而超聲波的空化作用能夠促進(jìn)樣品分解，加大樣品與溶劑的接觸面積，進(jìn)而提高提取率，故超聲輔助提取法是一種簡(jiǎn)單快速，有應(yīng)用前景的一種方法[30]；同樣，花青素苷的提取劑多樣，而以乙醇溶液為提取劑時(shí)，具有成本低，對(duì)環(huán)境污染較小等優(yōu)點(diǎn)，故以超聲輔助乙醇提取鳳仙花花青素苷。在實(shí)驗(yàn)中往往會(huì)出現(xiàn)一些特殊情況，如以超聲頻率為單因素時(shí)，在超聲頻率為95Hz處，花青素苷的提取率會(huì)突然下降，通過(guò)文獻(xiàn)查閱，發(fā)現(xiàn)姜桂全等研究表明：第一是因?yàn)槌暡ㄌ幚磉^(guò)程中空化泡沫劇烈壓縮和崩潰的瞬間，產(chǎn)生的熱氧化效應(yīng)造成花青素苷的損失，而當(dāng)熱氧化效應(yīng)造成的花青素苷的損失低于花青素苷提取增加速度時(shí)，花青素苷得率有所增加，第二，隨著超聲波的增加，與蛋白質(zhì)等結(jié)合的花青素苷被提取出來(lái)，所以當(dāng)超聲波熱氧化效應(yīng)大于花青素苷提取率時(shí)，會(huì)顯示為花青素苷的提取了降低，而在締合的花青素苷提取率高于超聲波熱氧化效應(yīng)時(shí)，花青素苷的提取率又會(huì)升高[25]。

有關(guān)于鳳仙花花青素苷的提取相關(guān)文獻(xiàn)較少，可能是鳳仙花種類(lèi)繁多，材料獲取不易，并且全部進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)實(shí)驗(yàn)量過(guò)大等。但將筆者實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他材料結(jié)果相比，筆者試驗(yàn)結(jié)果均高于其他材料結(jié)果：如鈕福祥等[31]對(duì)紫甘薯花青素苷的提取最優(yōu)提率為723.1mg·kg-1；楊敏等[32]對(duì)紫玉米花青素苷的提取最優(yōu)提率為3.542 mg·g-1；于莉莉等[27]對(duì)黑豆種皮花青素苷提取最優(yōu)提率為3.87 mg·g-1；徐娟等[33]對(duì)藍(lán)莓酒渣中花青素苷的提取最優(yōu)提率為4.67 mg·g-1，而筆者實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)提率為5.4039 mg·g-1，略高于其他材料。

目前對(duì)物質(zhì)進(jìn)行體外抗氧化研究時(shí)，評(píng)價(jià)指標(biāo)主要有：清除DPPH自由基、結(jié)晶紫法、亞硝基R鹽-Co2+褪色法、2-脫氧-D核糖法、鄰苯三酚(焦性沒(méi)食子酸)的自氧化法、TAB硫代巴比妥酸法、清除ABTS自由基、抑制肝臟線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)法、還原力測(cè)定、抑制雙氧水誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血能力實(shí)驗(yàn)、抑制蛋白質(zhì)羰基生成法等。筆者對(duì)花青素苷進(jìn)行抗氧化測(cè)定時(shí)，采取DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率以及對(duì)其還原力的測(cè)定，并分別與相同條件下維生素C對(duì)上述自由基清除能力以及還原力進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明鳳仙花花青素苷具有較好的抗氧化能力。

花青素苷的抗氧化機(jī)理與黃酮類(lèi)化合物通過(guò)酚羥基與自由基分子反應(yīng)生成較穩(wěn)定的半醌式自由基，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以減少并清除自由基[34]相似。花青素苷的特殊抗氧化機(jī)制是通過(guò)對(duì)自由基的清除、金屬離子的絡(luò)合以及對(duì)抗氧化酶系的促進(jìn)與激活[3]，進(jìn)而達(dá)到抗氧化效果。

花青素苷作為一種天然色素，受到了人們的廣泛關(guān)注，且在化妝品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)均具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后鳳仙花花青素苷的研究提供了一定的基礎(chǔ)，且超聲提取時(shí)超聲頻率對(duì)提取率影響最大以及超聲頻率為95Hz時(shí)提取率下降的原因給花青素苷的研究提供了一個(gè)新的探究方向。在今后的研究中，可以繼續(xù)尋求其最佳提取方法，優(yōu)化提純工藝；另一方面可以探究其大批量生產(chǎn)的最佳模式，為今后花青素苷的大規(guī)模應(yīng)用提供依據(jù)。