韓 超，耿玉萌，李淑穎，史萬(wàn)玉，翟向和

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001)

隨著氟苯尼考(florfenicol,FFC)在畜禽養(yǎng)殖中被大量使用,其毒副作用越來(lái)越引起關(guān)注。首先，F(xiàn)FC的耐藥性日益嚴(yán)重，例如：人獸共患的流感嗜血桿菌[1]、金黃桿菌[2]等對(duì)FFC多重耐藥的菌株不斷出現(xiàn)[3-4]。其次，F(xiàn)FC對(duì)動(dòng)物組織器官的損傷作用也不斷被報(bào)道,如抑制巨噬細(xì)胞吞噬[5]、淋巴細(xì)胞增殖[6]以及免疫反應(yīng)[7]和造血功能[8]，進(jìn)而導(dǎo)致疾病多發(fā)。此外，F(xiàn)FC濫用還可引起動(dòng)物肝腎損傷[9]，致使其在體內(nèi)的分解和排泄降低，導(dǎo)致FFC在動(dòng)物源性食品中超量殘留[10-11]，給公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重威脅。

目前，在肉雞養(yǎng)殖實(shí)踐中，F(xiàn)FC常常從1日齡就在肉雞飼料或飲水中低劑量添加，以對(duì)抗腸道細(xì)菌感染，進(jìn)而提高雛雞的成活率和生長(zhǎng)速度[12]。但在這一過(guò)程中，F(xiàn)FC還常被超量使用，因此FFC對(duì)肉雞的毒副作用不可避免[8]。近年來(lái)正常治療劑量FFC的毒副作用也被廣泛報(bào)道，可引起中度骨髓細(xì)胞發(fā)育不良[8]，并能促進(jìn)雞肝細(xì)胞的凋亡[13]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn):1日齡開(kāi)始給予FFC能顯著抑制雛雞早期的增重，損傷雛雞的造血功能，同時(shí)對(duì)雛雞的肝臟功能造成損傷[14]。但FFC早期給藥后，對(duì)肉雛雞中后期的生長(zhǎng)發(fā)育及肝臟功能是否還有明顯影響尚不明確，故本試驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料1日齡羅斯308肉雞購(gòu)自河北大午公司；FFC溶液購(gòu)自山東德州神牛藥業(yè)有限公司；谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)等生化試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；CYP1A1和CYP2H1 ELISA試劑盒購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司;總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒等購(gòu)自北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理120只1日齡的羅斯308肉雞被隨機(jī)分成6組，每組20只，分別為A組：雛雞從1日齡開(kāi)始正常飲水和飼喂飼料；B～F組:從1日齡開(kāi)始分別在飲用水中添加0.15(獸藥典推薦劑量)，0.30，0.60，1.20，1.80 g/L的FFC連用5 d。各組正常飼喂飼料，分別于21，42日齡，試驗(yàn)雞翅下靜脈采血，并處死采取雛雞的肝臟備用。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1測(cè)定增重和肝臟指數(shù) 各組1日齡雛雞記錄初始體質(zhì)量，飼喂到21和42日齡后再次對(duì)各組肉雞測(cè)體質(zhì)量，然后計(jì)算二者差值作為各組雛雞的體質(zhì)量增加量；并在各組隨機(jī)選取10只肉雞處死，摘取其肝臟測(cè)質(zhì)量計(jì)算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.3.2雞全血中白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(RGB)和血小板(PLT)的含量測(cè)定 采取各組42日齡雞血液置于抗凝管，將血液與抗凝劑充分混合，利用全自動(dòng)血液細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)全血中WBC、RBC、RGB和PLT的含量。

1.3.3雞血清中ALT、AST、TP和ALB的含量檢測(cè) 采取各組21，42日齡雞血液置于促凝管，將其以傾斜放置于4℃、1 h，然后低速離心分離得到血清。利用分光光度計(jì)測(cè)定D值，并計(jì)算各組雛雞血清中ALT、AST、TP和ALB的含量。

1.3.4檢測(cè)雞血清中MDA、CAT、GSH的含量 分離21，42日齡雞血清并制作10%的肝臟組織勻漿后，利用半自動(dòng)生化分析儀分別檢測(cè)雛雞血清中和肝組織勻漿中MDA、CAT、GSH的含量。具體參照文獻(xiàn)[15]方法進(jìn)行。

1.3.5RT-qPCR檢測(cè)肝組織內(nèi)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平 使用總RNA提取試劑盒(Promega，Beijing，China)從肝臟中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法檢測(cè)肝臟中CYP1A1、CYP2H1、Nrf2、HO-1、NQO-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。引物由TaKaRa(大連，中國(guó))設(shè)計(jì)合成(表1)。預(yù)變性處理為95℃ 120 s，擴(kuò)增進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，包括95℃ 5 s，64℃ 30 s，最后72℃ 30 s。內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，由2-ΔΔCt法計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

表1 引物信息

2 結(jié)果

2.1 不同劑量的FFC對(duì)肉雞增重的影響由表2可見(jiàn)，與空白組相比，21日齡時(shí)，0.15 g/L的FFC能引起雛雞增重顯著下降(P<0.05)，而其他劑量組的FFC能引起雛雞體質(zhì)量極顯著下降(P<0.01)。42日齡時(shí)，0.15和0.30 g/L的FFC能引起雛雞增重顯著下降(P<0.05)，而其他劑量組的FFC能引起雛雞體質(zhì)量極顯著下降(P<0.01)。

表2 各組雛雞平均增重 g

2.2 不同劑量的FFC對(duì)肉雞肝臟指數(shù)的影響與空白組相比，21日齡時(shí)，1.20 g/L的FFC能引起肉雞肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，而其他劑量組的肝臟指數(shù)沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。而42日齡時(shí)，1.20，1.80 g/L的FFC均能顯著提高肉雞肝臟指數(shù)(P<0.05)(表3)。

表3 各組肉雞的肝臟指數(shù)

2.3 不同劑量的FFC對(duì)雞全血中WBC、RBC、RGB和PLT含量的影響由表4可見(jiàn)，與空白組相比，僅1.20，1.80 g/L 的FFC能顯著降低肉雞血液中WBC的數(shù)量(P<0.05),而各劑量組的FFC均會(huì)導(dǎo)致全血中WBC的數(shù)量顯著降低(P<0.05)，各組雞全血中RGB的含量卻無(wú)顯著性差異(P>0.05)。另外，42日齡時(shí)，僅1.80 g/L的FFC仍會(huì)顯著降低肉雞全血中PLT的數(shù)量(P<0.05)。

表4 全血中各成分的計(jì)數(shù)

2.4 不同劑量的FFC對(duì)雞血清中ALT和AST含量的影響如圖1 所示，與空白組相比，各劑量組的FFC在21日齡時(shí)均能顯著增加雛雞血清中AST和ALT的含量(P<0.05),各組雛雞血清中AST和ALT的含量到42日齡時(shí)卻無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖1 各組雛雞血清中ALT(A)和AST(B)的含量

2.5 不同劑量的FFC對(duì)雞血清中TP和ALB含量的影響如圖2所示，F(xiàn)FC各處理組的雞血清中TP的含量在21日齡時(shí)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05),而42日齡時(shí)，與空白組相比，0.60,1.20,1.80 g/L 劑量的FFC仍會(huì)顯著降低雞血清中TP和ALB的含量(P<0.05)。

圖2 各組雛雞血清中TP(A)和ALB(B)的含量

2.6 不同劑量的FFC對(duì)雞血清GSH、MDA、CAT含量的影響如圖3所示，在21日齡時(shí)，與空白組相比，各劑量組的FFC均能顯著增加雞血清中MDA的含量(P<0.05)。同時(shí)測(cè)定肝組織中GSH和CAT含量發(fā)現(xiàn)，與空白組相比較，只有0.60，1.20，1.80 g/L劑量的FFC能顯著減低肉雞血清中GSH和CAT的含量；在42日齡時(shí)，與空白對(duì)照組相比，僅1.20，1.80 g/L劑量的FFC能顯著增加肉雞血清中MDA的含量(P<0.05)，顯著降低肉雞血清中 GSH和CAT的含量(P<0.05)。

圖3 各組雛雞血清和肝組織中GSH、MDA和CAT的含量

2.7 不同劑量的 FFC對(duì)雞肝組織中肝藥酶CYP1A1和CYP2H1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響如圖4所示，檢測(cè)CYP1A1和CYP2H1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)：在21日齡時(shí)，與空白組相比，各FFC劑量組的雛雞肝組織內(nèi)CYP1A1和CYP2H1 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降(P<0.05)；42日齡時(shí)，只有0.60,1.20,1.80 g/L劑量組肉雞肝組織CYP1A1 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于空白組(P<0.05);而CYP2H1 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平各組之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖4 各組肉雞肝組織中CYP1A1(A)和CYP2H1(B)mRNA轉(zhuǎn)錄水平

2.8 不同劑量的FFC對(duì)雞肝組織中Nrf2通路蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響Nrf2蛋白通路是調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激的重要途徑，如圖5所示，在21日齡時(shí)，與空白對(duì)照組相比，0.15,1.20,1.80 g/L FFC能顯著降低肝臟中Nrf2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05);0.60，1.20，1.80 g/L FFC能顯著降低肝臟中HO-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05 );1.20，1.80 g/L FFC能顯著降低肝臟中NQO-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)。而到42日齡時(shí)，各個(gè)FFC劑量組雛雞肝臟內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)與空白組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與空白組相比，1.20，1.80 g/L FFC能顯著降低肝臟中HO-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄(P<0.05)，而僅1.80 g/L 的FFC組與空白組相比較能顯著減少雞肝臟組織中NQO-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)。

圖5 各組雛雞肝組織中Nrf2(A)，HO-1(B)和NQO-1(C)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

FFC作為氯霉素的替代產(chǎn)品，具有氯霉素類抗生素類似的功效，但副作用卻較小，故成為畜禽疾病防治的常用藥物[16]。但是，F(xiàn)FC在動(dòng)物養(yǎng)殖中已應(yīng)用多年，F(xiàn)FC(包括正常治療劑量)的耐藥性及毒副作用也被廣泛報(bào)道。

HAN等[14]前期研究發(fā)現(xiàn)，正常推薦治療劑量(0.15 g/L)的FFC對(duì)7日齡以內(nèi)肉雞的生長(zhǎng)性能、造血功能以及肝臟的功能均有一定的損傷作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在5日齡用藥結(jié)束后的21和42日齡時(shí)，正常推薦治療劑量(0.15 g/L)及更大劑量FFC仍顯著抑制肉雞的增重，降低RBC數(shù)量(P<0.05)；說(shuō)明FFC作為“開(kāi)口藥”早期應(yīng)用后，對(duì)肉雞的生長(zhǎng)性能和造血功能的損傷是持續(xù)存在的。

ALT和AST是肝臟細(xì)胞胞內(nèi)酶，血清中含量上升就意味著肝臟細(xì)胞完整性受損，因此血清AST和ALT的含量是評(píng)價(jià)肝臟損傷的重要指標(biāo)[17]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，不同劑量的FFC在21日齡時(shí)均能顯著增加雛雞血清中AST和ALT的含量(P<0.05)；各組雛雞血清中AST和ALT的含量到42日齡時(shí)與空白對(duì)照組間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；肝臟是血清中TP和ALB合成場(chǎng)所，血清中TP和ALB的含量能反映肝臟的功能。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)FC各劑量組雞血清中TP和ALB的含量在21日齡時(shí)均顯著低于空白組(P<0.05),而到了42日齡時(shí)，0.60，1.20，1.80 g/L劑量的FFC仍會(huì)顯著降低雞血清中TP和ALB的含量(P<0.05)。由此可知，早期給予推薦劑量的FFC在肉雞生長(zhǎng)到21日齡時(shí)對(duì)肝臟仍有損傷作用，到了42日齡時(shí)這種損傷基本得以修復(fù)，而超劑量的FFC對(duì)肝臟的損傷一直持續(xù)到肉雞出欄。

氧化應(yīng)激是由細(xì)胞過(guò)度產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和親電體引起的，而過(guò)量的ROS又可以誘導(dǎo)自由基鏈反應(yīng)，破壞細(xì)胞生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等，并誘發(fā)一系列生活習(xí)慣性疾病[18-19]。故肝臟內(nèi)的氧化應(yīng)激程度可以反映肝臟的功能狀況[20]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在21，42日齡時(shí)，正常推薦劑量的FFC基本不會(huì)引起肝臟的氧化應(yīng)激損傷，而一旦超過(guò)推薦劑量，就會(huì)對(duì)肝臟的氧化應(yīng)激損傷很嚴(yán)重。機(jī)體為控制ROS水平并防止其積累，形成了一套復(fù)雜的抗氧化防御體系，其中核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是一種重要的氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子[21]，其通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的組成型和誘導(dǎo)型表達(dá)，有利于改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞存活以及維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)[22-23]。HAN等[14]的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7日齡內(nèi)，推薦治療劑量的FFC就能引起肉雞肝臟組織內(nèi)Nrf2 mRNA的轉(zhuǎn)錄顯著下降；而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，21日齡時(shí)，只有超量的FFC才能引起肉雞肝臟組織內(nèi)Nrf2 mRNA的轉(zhuǎn)錄顯著下降，而42日齡時(shí)，F(xiàn)FC的劑量不超過(guò)1.80 g/L時(shí)均不會(huì)引起肝臟組織內(nèi)Nrf2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(P>0.05)。另外，NOQ-1和HO-1作為Nrf2-ARE通路上的下游蛋白，在機(jī)體內(nèi)協(xié)同發(fā)揮抗氧化的作用,同時(shí)又受到Nrf2蛋白的調(diào)控[24-25]。理論上，NOQ-1和HO-1在機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)表達(dá)會(huì)增加，進(jìn)而減輕機(jī)體的氧化應(yīng)激[26]。HAN等[14]的前期研究結(jié)果顯示，7日齡內(nèi)，推薦治療劑量的FFC同樣也能引起肉雞肝臟組織內(nèi)HO-1和NQO-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，21和42日齡時(shí)，只有遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)推薦劑量的FFC才能顯著抑制Nrf2、NQO-1和HO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。說(shuō)明隨著肉雞日齡的增長(zhǎng)，正常推薦劑量的FFC對(duì)肝臟的氧化損傷基本消失，其原因可能是其對(duì)肝臟組織中Nrf2通路上抗氧化蛋白Nrf2、HO-1和NQO-1的表達(dá)抑制減輕，恢復(fù)了肝臟抵抗氧化應(yīng)激的能力，進(jìn)而對(duì)肝臟的損傷減輕。

藥物本身或代謝產(chǎn)物可直接損傷肝臟細(xì)胞，導(dǎo)致肉雞肝臟損傷最常見(jiàn)的就是抗生素、黃曲霉毒素、重金屬等，它們的代謝產(chǎn)物大多具有肝毒性[27]。藥物在肝臟中需進(jìn)行兩步反應(yīng)，即Ⅰ相和Ⅱ相反應(yīng)。Ⅰ相反應(yīng):將藥物進(jìn)行水解、氧化、還原，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，主要的代謝酶是細(xì)胞色素 P450(CYP)、CYP1A1及 CYP2H1 等都是導(dǎo)致藥物性肝損傷相關(guān)的關(guān)鍵性氧化酶[28]。因此，肝細(xì)胞內(nèi)肝藥酶的含量對(duì)肝臟的解毒能力有直接的關(guān)系。之前我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使推薦治療劑量的FFC也會(huì)引起肉雛雞(不超過(guò)7日齡)肝臟內(nèi)CYP1A1和CYP2H1的含量會(huì)顯著下降，并且呈劑量依賴性。說(shuō)明FFC可能夠通過(guò)抑制肝臟內(nèi)肝藥酶的活性，進(jìn)而增加FFC在肉雞體內(nèi)的代謝時(shí)間，增加FFC在體內(nèi)的殘留。而21日齡時(shí)，各個(gè)劑量FFC依舊會(huì)抑制肝臟內(nèi)CYP1A1和CYP2H1的含量及mRNA轉(zhuǎn)錄水平，到42日齡時(shí)，只有超過(guò)0.15 g/L的FFC會(huì)顯著抑制肉雞肝臟內(nèi)CYP1A1和CYP2H1的含量及mRNA轉(zhuǎn)錄水平。由此可知，正常推薦劑量FFC對(duì)肝臟內(nèi)肝藥酶表達(dá)的影響隨著肉雞的生長(zhǎng)而逐漸減弱，而一旦FFC的劑量超過(guò)正常推薦劑量，其對(duì)肝臟內(nèi)肝藥酶的表達(dá)有持續(xù)性抑制作用。