王 勇,袁麗佳，胡松華

(浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

偽狂犬病(pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(PRV)所引起的動(dòng)物傳染病，PRV屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、豬皰疹病毒屬。PRV對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大，成年豬呈隱形感染，長(zhǎng)期帶毒排毒，這是導(dǎo)致PR長(zhǎng)期流行、難以根除的重要原因，嚴(yán)重影響豬場(chǎng)的產(chǎn)能和效益，是制約我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一。接種疫苗是防控該病的重要措施。我國(guó)將PR列入優(yōu)先防制的動(dòng)物疫病之一[1-3]。然而，在生產(chǎn)中，有些PR疫苗的免疫效果差，不能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致PR在一些豬場(chǎng)得不到有效控制[4]。因此，尋求提高豬PR疫苗免疫效果的方法，對(duì)臨床上控制PR具有重要意義。

人參莖葉皂苷(GSLS)是一種從人參的莖和葉中獲得的提取物。研究表明，GSLS對(duì)多種動(dòng)物疫苗如口蹄疫疫苗、雞新城疫疫苗、H5N1禽流感滅活疫苗和PR弱毒疫苗等具有免疫增強(qiáng)作用[5-7]。以GSLS為主要成分的人參莖葉總皂苷顆粒已由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)為新獸藥((2017)新獸藥字證20號(hào))上市[8]。硒(Se)作為一種微量元素，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用，廣泛應(yīng)用在畜牧業(yè)生產(chǎn)中[9-10]。BABAR等[11]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠口服GSLS后接種添加了Se的PR疫苗能顯著提高疫苗的免疫效果。為了進(jìn)一步豐富和優(yōu)化GSLS和Se在臨床上的應(yīng)用，本試驗(yàn)以小鼠為模型，研究一種含GSLS和Se的GSe溶液對(duì)PR疫苗的免疫增強(qiáng)作用，并探討其作用機(jī)理，為臨床上提高動(dòng)物的抗病力提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠，雌性，6～8周齡，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。小鼠自由采食與飲水，飼養(yǎng)于IVC獨(dú)立送風(fēng)飼養(yǎng)籠具，室內(nèi)條件為溫度(25±1)℃，濕度50%±10%。小鼠于試驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 細(xì)胞、病毒和疫苗小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7由浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院中獸醫(yī)研究室保存；偽狂犬病病毒野毒株(fPRV)，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈(zèng)；PR疫苗購(gòu)自武漢科前生物股份有限公司。

1.3 主要試劑和藥品豬PRV gB抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；人參莖葉皂苷(GSLS)購(gòu)自吉林宏久生物科技股份有限公司；亞硒酸鈉(Na2SeO3，Se)購(gòu)自上海今品化學(xué)技術(shù)有限公司；刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)和MTT購(gòu)自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、Hank’s液、胰酶消化液(0.25% 胰酶 + 0.02% EDTA)購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG1、IgG2a抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；FITC標(biāo)記的CD40 (Clone:HM40-3)、CD80 (Clone:16-10A1) 和CD86 (Clone:GL1)流式抗體購(gòu)自ebioscience公司；小鼠 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。

1.4 GSe注射次數(shù)對(duì)PR疫苗誘導(dǎo)抗體水平的影響將小鼠隨機(jī)分為8組，每組6只，第1～3組小鼠免疫PR疫苗前，分別肌肉注射0.2 mL GSe溶液(6 μg GSLS + 2 μg Se)1，2，3次；第4～6組小鼠免疫PR疫苗前，分別肌肉注射等量的生理鹽水1，2，3次；第7，8組小鼠分別為PR疫苗對(duì)照組和空白對(duì)照組。每只小鼠每次免疫稀釋100倍的PR疫苗0.1 mL(下同)，免疫2次，間隔2周二免，于二免后2周對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢采血，分離血清，使用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中g(shù)B抗體水平。

1.5 GSe注射劑量對(duì)PR疫苗誘導(dǎo)抗體水平的影響將小鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，第1～3組小鼠免疫PR疫苗前，分別肌肉注射質(zhì)量濃度為(30 mg/L GSLS + 10 mg/L Se)的GSe溶液 0.1，0.2，0.3 mL；第4，5組小鼠分別為PR疫苗對(duì)照組和空白對(duì)照組。每只小鼠免疫2次，間隔2周二免，于二免后2周對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢采血，分離血清，使用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中g(shù)B抗體水平。

1.6 動(dòng)物分組及免疫將小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，第1組小鼠免疫PR疫苗前，肌肉注射1次GSe溶液0.2 mL(30 mg/L GSLS + 10 mg/L Se)，第2，3組小鼠分別為PR疫苗對(duì)照組和空白對(duì)照組。每只小鼠免疫2次，間隔2周二免，于二免后1，2，3周對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶靜脈叢采血，分離血清，使用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中g(shù)B抗體及其亞類水平。二免后3周分離脾臟，制備脾淋巴細(xì)胞，檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子水平。

1.7 gB抗體及其亞類檢測(cè)按ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清中特異性PRV gB抗體水平。使用同樣的ELISA檢測(cè)試劑盒，向試劑盒包被板中加入100 μL/孔的待檢測(cè)血清(1∶2稀釋)，室溫條件下孵育60 min，洗滌液洗板3～5次，將板拍干，每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG1或IgG2a抗體(1∶1 000)，37℃孵育60 min;洗滌液洗板3～5次，將板拍干，每孔加入100 μL TMB底物溶液，室溫條件孵育15 min后每孔加入50 μL終止液，在酶標(biāo)儀上測(cè)定D450 nm值。

1.8 攻毒保護(hù)試驗(yàn)小鼠加強(qiáng)免疫后2周，腹腔注射致死劑量的fPRV(5×105TCID50)，連續(xù)觀察10 d，并記錄小鼠臨床癥狀和死亡情況。

4月18日，水利部抗震救災(zāi)前方領(lǐng)導(dǎo)小組組長(zhǎng)、青海省水利廳抗震救災(zāi)前線指揮部總指揮于叢樂(lè)廳長(zhǎng)、副總指揮張世豐、張偉副廳長(zhǎng)分別帶領(lǐng)搶險(xiǎn)分隊(duì)深入一線，詳查供水設(shè)施、禪古電站安全隱患，巡查巴塘河、扎西科河兩岸滑坡淤塞河道情況，研究應(yīng)急供水和禪古電站水庫(kù)大壩應(yīng)急處置方案。

1.9 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)將小鼠斷頸處死，于75%酒精浸泡5 min；無(wú)菌條件下分離脾臟，加入5 mL完全Hank's液，使用研缽研磨后過(guò)200目銅網(wǎng)，濾液離心(1 500 r/min，10 min)，棄上清，向底物中加入3 mL紅細(xì)胞裂解液，輕輕振蕩混勻；4℃靜止3 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，向沉淀物中加入3 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/mL，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔。隨后，分別使用5 mg/L Con A、5 mg/L LPS和5×105TCID50/mL滅活fPRV (水浴56℃滅活30 min)抗原刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞，在恒溫培養(yǎng)箱中37℃、5% CO2培養(yǎng)44 h，向每孔中加入20 μL MTT(5 g/L)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心培養(yǎng)板(1 800 r/min 10 min)并小心棄掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩溶解結(jié)晶后置于酶標(biāo)儀上測(cè)量D570 nm。刺激指數(shù)(SI)的計(jì)算公式如下：SI=(刺激孔D值-空白孔D值)/(未刺激孔D值-空白孔D值)。

1.10 細(xì)胞因子檢測(cè)按1.9方法收集脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/mL，5×105TCID50/mL滅活fPRV (水浴56℃滅活30 min)抗原刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集上清液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，檢測(cè)IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10的分泌水平。

1.11 GSe對(duì)巨噬細(xì)胞的影響將巨噬細(xì)胞RAW 264.7按5×105個(gè)/孔加到24孔培養(yǎng)板中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，使用GSe(60 μg/L GSLS + 20 μg/L Se)和LPS(100 μg/L)刺激細(xì)胞；只加DMEM完全培養(yǎng)基的為細(xì)胞對(duì)照組，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，離心收集細(xì)胞上清液，使用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子IL-6、IL-10和TNF-α水平。收集細(xì)胞，使用1% BSA-PBS將細(xì)胞洗2次后，用CD16/CD32抗體阻斷FcR 10 min，并將細(xì)胞用FITC標(biāo)記的CD40、CD80 和 CD86避光條件下染色30 min。染色結(jié)束后，1 500 r/min 離心8 min， 收集細(xì)胞，將細(xì)胞用PBS重懸后，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 注射不同次數(shù)的GSLS-Se對(duì)PR疫苗誘導(dǎo)抗體反應(yīng)的影響由圖1A可知， 與PR疫苗組和免疫前注射生理鹽水組相比，PR疫苗免疫前分別肌肉注射0.2 mL含6 μg GSLS + 2 μg Se的GSe溶液1，2，3次(0.2 mL·次-1·d-1)均能顯著提高二免后2周小鼠血清中PRV特異性gB抗體水平(P<0.05)。

圖1 注射不同次數(shù)(A)和不同劑量(B)GSLS-Se對(duì)PR疫苗抗體反應(yīng)的影響

2.2 注射不同劑量GSLS-Se對(duì)PR疫苗誘導(dǎo)抗體反應(yīng)的影響由圖1B可知，與PR疫苗組相比，PR疫苗免疫前分別肌肉注射0.1，0.2 mL GSe溶液(30 mg/L GSLS+10 mg/L Se)，能夠顯著提高小鼠血清中PRV特異性gB抗體水平(P<0.05)，當(dāng)注射體積為0.3 mL時(shí)， gB抗體水平只是較疫苗對(duì)照組在數(shù)值上有所提高(P>0.05)。

2.3 GSe提高小鼠血清特異性PRV gB抗體及其亞類水平由圖1結(jié)果可知，確定免疫前給小鼠肌肉注射1次GSe溶液(0.2 mL含6 μg GSLS+2 μg Se的溶液)為最終注射方案。由圖2A～C可知，與疫苗組相比，免疫前注射GSe溶液(GSe/pre-PR)能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更高水平的血清PRV特異性IgG及其亞類(P<0.05)。

2.4 GSe提高PR疫苗免疫小鼠的攻毒保護(hù)作用在攻毒試驗(yàn)中，攻毒fPRV后48 h，空白對(duì)照和GSe對(duì)照組小鼠首先出現(xiàn)啃咬后背、瘙癢、抽搐、共濟(jì)失調(diào)和癱瘓等明顯的神經(jīng)癥狀，并在攻毒后60～72 h全部死亡。疫苗對(duì)照組小鼠在攻毒后60～72 h開(kāi)始死亡，最終小鼠存活率為40%(4/10)，這一結(jié)果低于GSe/pre-PR組小鼠的70%(7/10)(圖2D)。

圖2 GSe對(duì)PRV 特異性IgG及其亞類水平(A～C)和免疫小鼠攻毒后生存率(D)的影響

2.5 GSe增強(qiáng)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力由圖3知，與PR疫苗組相比，GSe/pre-PR組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)ConA、LPS和PRV抗原刺激后的增殖能力顯著提高(P<0.05)。

2.6 GSe提高免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子水平由圖4可知，與PR疫苗組相比，GSe/pre-PRV能夠顯著增強(qiáng)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)PRV抗原刺激后Th1型(IFN-γ和IL-2)和Th2型(IL-4、IL-6、IL-10)細(xì)胞因子的分泌能力(P<0.05)。

A.ConA;B.LPS;C.PRV

圖4 GSe/pre-PR對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子水平的影響

2.7 GSe增強(qiáng)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平由圖5可知，與細(xì)胞對(duì)照組相比，當(dāng)使用含60 μg/L GSLS和20 μg/L Se的GSe刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞因子IL-6、IL-10和TNF-α的分泌水平顯著提高(P<0.05)。

圖5 GSe對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞因子分泌的影響

2.8 GSe提高巨噬細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)水平由圖6可知，與細(xì)胞對(duì)照組相比，當(dāng)使用含60 μg/L GSLS和20 μg/L Se的GSe刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7 24 h后， GSe能夠顯著提高細(xì)胞表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)水平(P<0.05)。

圖6 GSe對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)的影響

3 討論

體液免疫在宿主防御PRV過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[12]。作為一種PRV囊膜表面的糖蛋白，gB能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有保護(hù)性的抗體，可作為評(píng)價(jià)接種PR疫苗后誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫水平[13]。本試驗(yàn)中，GSe溶液能夠顯著提高免疫小鼠血清gB抗體及其亞類(IgG1和IgG2a)水平，說(shuō)明GSe能增強(qiáng)PR疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫水平。細(xì)胞免疫在機(jī)體抗病毒免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。通常，淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子水平可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫水平的指標(biāo)。對(duì)淋巴細(xì)胞而言，Con A主要刺激T細(xì)胞，LPS主要刺激B細(xì)胞[14]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GSe/pre-PR能顯著提高脾淋巴細(xì)胞對(duì)Con A、LPS和PRV抗原刺激后的增殖能力。細(xì)胞因子在Th細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用，可誘導(dǎo)Th細(xì)胞分化產(chǎn)生Th1和Th2型等細(xì)胞因子。其中，Th1型免疫主要產(chǎn)生IFN-γ、IL-2、IL-12和IgG2a，Th2型主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IgG1[15]。本研究結(jié)果顯示，GSe/pre-PR能夠顯著提高小鼠淋巴細(xì)胞Th1型(IFN-γ、IL-2)和Th2型(IL-4、IL-6、IL-10)細(xì)胞因子水平，說(shuō)明GSe/pre-PR能夠提高小鼠Th1/Th2型細(xì)胞免疫水平。此外，攻毒試驗(yàn)是評(píng)價(jià)疫苗對(duì)機(jī)體保護(hù)力的重要指標(biāo)。在本試驗(yàn)中，GSe/pre-PR組小鼠攻毒后的最終存活率為70%，高于PR疫苗組的40%。綜上說(shuō)明，GSe溶液能同時(shí)提高PR疫苗誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生有效的體液免疫和細(xì)胞免疫水平。

作為一種抗原提呈細(xì)胞(APC)，巨噬細(xì)胞是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要免疫細(xì)胞。T細(xì)胞經(jīng)“MHC-抗原肽-TCR”作為第一信號(hào)刺激后，還需APC表面的共刺激分子如CD40、CD80、CD86等作為第二信號(hào)刺激后才能活化[16]。活化的T細(xì)胞可促進(jìn)APC活化并表達(dá)更多的共刺激分子，進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞活化和增殖[17]。激活的巨噬細(xì)胞可分為M1型和M2型，M1型細(xì)胞分泌IL-6和TNF-α等促炎細(xì)胞因子參與Th1型免疫；M2型細(xì)胞主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，可分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10、TGF-β和一些趨化因子，促進(jìn)Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[18]。本研究結(jié)果顯示，GSe能通過(guò)提高IL-6、IL-10和TNF-α的分泌水平來(lái)促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的活化，說(shuō)明GSe能夠同時(shí)激活M1和M2型巨噬細(xì)胞。此外，GSe可通過(guò)提高CD40、CD80和CD86的表達(dá)水平增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗原提呈能力。由此說(shuō)明， GSe溶液對(duì)PR疫苗的免疫增強(qiáng)作用與其提高巨噬細(xì)胞的活性有關(guān)，而GSe能同時(shí)誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生Th1和Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)，很可能與GSe能誘導(dǎo)平衡的M1/M2巨噬細(xì)胞分化相關(guān)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，GSe溶液能提高小鼠對(duì)PR疫苗的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，并增強(qiáng)免疫動(dòng)物對(duì)PRV的抵抗能力。同時(shí)，GSe可通過(guò)提高巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子水平和抗原提呈能力發(fā)揮其免疫增強(qiáng)作用。但GSe溶液在臨床上如何提高動(dòng)物抵抗疫病方面還有待進(jìn)一步研究。