張林吉，遲 蘭，李心海，王玉燕，房 超，任士飛*

(1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221006；2.中華人民共和國(guó)徐州海關(guān)，江蘇 徐州 221003)

鴨沙門菌病(duck Salmonellosis)又稱為鴨副傷寒，是鴨的一種急、慢性傳染病，主要由于鴨感染了一種或幾種沙門菌而引起，病原菌主要包括腸炎沙門菌、鴨沙門菌和印第安納沙門菌等[1-2]。鴨沙門菌病多發(fā)生于雛鴨，3周齡內(nèi)雛鴨特別易感，感染后常呈現(xiàn)急性敗血癥，發(fā)病率和死亡率都很高[3]。成年鴨感染后不表現(xiàn)出明顯臨床癥狀，多呈現(xiàn)慢性或隱性感染，通過(guò)糞便長(zhǎng)期排菌，但有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床疾病，并伴有高死亡率。

鴨沙門菌病的防治主要依賴于抗菌藥物的使用，但隨著沙門菌耐藥性逐漸增強(qiáng)，加之大規(guī)模高密度集約化飼養(yǎng)管理造成機(jī)體免疫力降低，使得藥物治療的效果越來(lái)越差。沙門菌疫苗的研制已成此病防控技術(shù)研究的主要方向，研制出能夠有效控制鴨沙門菌病的有效疫苗，將為今后有效控制沙門菌病提供重要的工具。

目前，我國(guó)針對(duì)沙門菌疫苗的研制主要以雞和豬的沙門菌疫苗為主，而針對(duì)鴨的沙門菌疫苗較少。本研究根據(jù)徐州及周邊地區(qū)鴨源沙門菌血清型分布情況，篩選出印第安納沙門菌、阿貢納沙門菌和鴨沙門菌3株不同血清型菌株，采用傳統(tǒng)方法制備油乳滅活疫苗，評(píng)價(jià)制備疫苗的性狀；對(duì)試驗(yàn)鴨進(jìn)行免疫接種，從體液免疫和細(xì)胞免疫方面對(duì)免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為鴨源沙門菌疫苗的防控效果提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料印第安納沙門菌(S.indiana4∶z∶1,7)、阿貢納沙門菌(S.agona4∶f,g,s)和鴨沙門菌(S.anatum10∶e,h∶1,6)3株鴨源沙門菌為徐州動(dòng)物疫病檢測(cè)中心分離鑒定并保存；胰蛋白胨和酵母浸粉購(gòu)自O(shè)XOID公司；Hanks液、淋巴細(xì)胞分離液和賴氨酸等化學(xué)試劑購(gòu)自南京智睿生物科技有限公司；0.5%綿羊紅細(xì)胞懸液自備；沙門菌抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海瓦蘭生物科技有限公司；ANgni乳化機(jī)購(gòu)自上海昂尼儀器儀表有限公司；1日齡櫻桃谷肉鴨購(gòu)自徐州佳合有限公司，隔離飼養(yǎng)于潔凈動(dòng)物舍。

1.2 疫苗制備

1.2.1菌液制備及滅活 將制備菌株接種到含有300 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃培養(yǎng)18 h作為種子液，按4%比列接種到裝有6 L滅菌的沙門菌合成液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。3種菌株的發(fā)酵條件基本一致，具體參數(shù)如下：38℃通氣培養(yǎng)，攪拌速度為150 r/min；調(diào)節(jié)通氣量使溶氧指數(shù)保持40%左右，培養(yǎng)過(guò)程中滴加賴氨酸溶液，保持溶液pH值為7.3～7.6；培養(yǎng)20 h收集菌液，進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)和雜菌檢驗(yàn)，合格后，菌液離心濃縮，調(diào)整菌液濃度為120×106/mL，再加入終濃度為0.5%的甲醛滅活72 h，無(wú)菌檢驗(yàn)后備用。

1.2.2疫苗乳化 滅活的混合抗原液(1∶1∶1)混合與滅菌Tween-80按照96∶4的比例混合制備成水相；白油與司本-80按照94∶6的比例混合，加入1%的硬脂酸鋁，充分?jǐn)嚢杌靹颍?21℃高壓滅菌30 min，為油相。水相和油相以1∶3的比例使用ANgni乳化機(jī)進(jìn)行乳化，7 000 r/min高速勻漿2.5 min，間隔2 min，重復(fù)3次，即制備多價(jià)油乳劑滅活疫苗。

1.3 疫苗性狀檢驗(yàn)劑型檢驗(yàn)：觀察油乳劑滅活疫苗的外觀，將疫苗滴入盛有室溫蒸餾水的平皿表面，觀察疫苗擴(kuò)散情況。如呈規(guī)則圓形則為油包水劑型，若迅速散開(kāi)則為水包油劑型。穩(wěn)定性檢驗(yàn)：取油乳劑滅活疫苗10 mL，3 000 r/min離心15 min，觀察其是否出現(xiàn)分層、破乳等現(xiàn)象。黏度測(cè)定：用上口徑為2.7 mm，下口徑為1.2 mm的玻璃吸管，記錄在室溫(25℃)下吸滿1 mL油乳劑滅活疫苗垂直流出0.4 mL所需的時(shí)間，重復(fù)3次取平均值。

1.4 無(wú)菌檢驗(yàn)按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》的方法[4]，將油乳劑滅活疫苗分別接種于硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、酪胨瓊脂培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，分別置于25℃培養(yǎng)7 d和37℃培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)微生物生長(zhǎng)。同時(shí)，將疫苗接種到改良的Frey固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1個(gè)月，觀察有無(wú)支原體生長(zhǎng)。

1.5 安全性檢驗(yàn)取10日齡櫻桃谷雛鴨30只，每組15只，注射油乳劑滅活疫苗1 mL，一組做肌肉注射，另一組做皮下注射；另取10只不接種疫苗作為空白對(duì)照。接種之日起，觀察接種雛鴨的生長(zhǎng)情況，接種14 d時(shí)，剖檢全部接種實(shí)驗(yàn)鴨，檢查接種部位和全身臟器變化，以評(píng)價(jià)其安全性。

1.6 免疫效力檢測(cè)

1.6.1抗體水平和細(xì)胞免疫檢測(cè) 將65只10日齡櫻桃谷肉鴨分為3組，分別為空白對(duì)照組，15只，每只肌肉注射0.5 mL生理鹽水；免疫1組，25只，每只肌肉注射油乳劑滅活疫苗0.5 mL；免疫2組，25只，肌肉注射疫苗0.5 mL，7 d后，同樣劑量進(jìn)行二次免疫接種?？贵w水平檢測(cè)：首免疫后0，7，14，21，28，35，42，49 d采血分離血清，每組每批采10份樣品，用沙門菌抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中免疫抗體水平[5]。細(xì)胞免疫檢測(cè)：首免疫后，每間隔7 d采血分離鴨淋巴細(xì)胞，利用E玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)測(cè)定不同時(shí)間鴨T淋巴細(xì)胞數(shù)量，檢測(cè)7周，具體操作參照文獻(xiàn)[6]。

1.6.2攻毒保護(hù)試驗(yàn) 200只櫻桃谷肉鴨隨機(jī)分為空白對(duì)照組、攻毒組和免疫攻毒組，10日齡時(shí)，空白對(duì)照組和攻毒組每只肌肉注射生理鹽水0.5 mL，免疫攻毒組每只肌肉注射滅活疫苗0.5 mL；7 d后，攻毒組和免疫攻毒組進(jìn)行攻毒，肌肉注射攻毒菌株，具體分組及攻毒情況見(jiàn)表1。攻毒后觀察記錄各組動(dòng)物發(fā)病及死亡情況，觀察21 d，統(tǒng)計(jì)死亡率及存活率。

表1 分組免疫及攻毒情況

2 結(jié)果

2.1 性狀檢驗(yàn)制備的油乳劑滅活疫苗為白色乳液，鏡檢質(zhì)地均一，無(wú)顆粒狀雜質(zhì)，漂浮于蒸餾水表面，呈規(guī)則圓形，邊緣圓滑規(guī)整，表明該制劑為油包水劑型。疫苗經(jīng)3 000 r/min離心15 min后，沒(méi)有出現(xiàn)分層、破乳現(xiàn)象，疫苗穩(wěn)定性良好。疫苗自然垂直流出0.4 mL的平均時(shí)間為4.83 s (4.7，5.1，4.6 s)，符合油乳劑滅活疫苗的黏度要求(2～8 s)。

2.2 無(wú)菌檢驗(yàn)將油乳劑滅活疫苗接種到各培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后無(wú)細(xì)菌、霉菌及支原體等微生物生長(zhǎng)，疫苗無(wú)菌檢驗(yàn)合格。

2.3 安全性檢驗(yàn)疫苗接種當(dāng)日，接種雛鴨表現(xiàn)出輕微的臨床癥狀，與對(duì)照組相比，采食量減少了30%左右，飲水減少了10%～15%，運(yùn)動(dòng)量明顯減少，喜臥，至接種后2 d，皮下和肌肉接種組的實(shí)驗(yàn)鴨精神飲食逐漸恢復(fù)正常。第14天剖殺，皮下注射組實(shí)驗(yàn)鴨注射部位殘存少量未吸收的疫苗液體，肌肉注射組疫苗吸收良好，未見(jiàn)殘留。觀察期內(nèi)3組實(shí)驗(yàn)鴨全部健康存活，無(wú)明顯臨床癥狀。

2.4 免疫效力檢測(cè)

2.4.1抗體水平檢測(cè)結(jié)果 由圖1可見(jiàn)，免疫后7 d，免疫組抗體水平逐漸升高，免疫1組和免疫2組分別于免疫后21，35 d抗體水平達(dá)到峰值，然后開(kāi)始緩慢降低。免疫后1周，免疫1組與空白對(duì)照組的抗體水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≤0.05)，21 d為極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≤0.01)，35 d后2組之間的抗體水平未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；免疫后7～14 d，免疫2組與空白對(duì)照組的抗體水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≤0.05)，至免疫后49 d時(shí)依然維持在較高水平，抗體水平存在極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≤0.01)。

空白對(duì)照組與免疫1組比較，#P≤0.05，##P≤0.01；空白對(duì)照組與免疫2組比較，*P≤0.05，**P≤0.01。下同

2.4.2E玫瑰花環(huán)檢測(cè)結(jié)果 E玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞結(jié)果顯示，免疫后7 d，免疫1組和免疫2組的E玫瑰花環(huán)形成率開(kāi)始高于空白對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≤0.05)， 14～49 d有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≤0.01)，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 E玫瑰花環(huán)形成率檢測(cè)結(jié)果 %

2.4.3攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 觀察雛鴨臨床表現(xiàn)，攻毒組和免疫攻毒組的雛鴨在攻毒后24 h左右出現(xiàn)食欲降低、懼寒扎堆和嗜睡等臨床表現(xiàn)，36 h開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)死亡?？瞻讓?duì)照組未見(jiàn)臨床癥狀，無(wú)死亡；攻毒5,6，8組于攻毒后第1周內(nèi)全部死亡，攻毒7組死亡19只，存活1只；免疫攻毒1組和4組都死亡3只，存活22只，免疫攻毒2組死亡2只，存活23只，免疫攻毒3組全部存活，具體各組的死亡率和存活率結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

由于沙門菌血清型多達(dá)2 500多種，很難確定作為標(biāo)準(zhǔn)的沙門菌疫苗菌株，因此根據(jù)不同地區(qū)流行的沙門菌株，研制成滅活疫苗是有效預(yù)防沙門菌病的重要技術(shù)關(guān)鍵，通?？梢允盏搅己玫念A(yù)防效果[7]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)對(duì)鴨沙門菌多價(jià)滅活疫苗的各項(xiàng)檢驗(yàn)，證明疫苗無(wú)菌檢驗(yàn)、物理性狀等指標(biāo)符合要求。

疫苗的免疫效果通常包括抗體免疫水平和細(xì)胞免疫水平。本研究通過(guò)檢測(cè)血清中抗體水平的變化規(guī)律來(lái)反應(yīng)抗體免疫水平，檢測(cè)結(jié)果顯示空白對(duì)照組的雛鴨在10日齡免疫時(shí)依然保持一定的母源抗體水平，隨日齡增長(zhǎng)其母源抗體逐漸下降，這與金大春等[8]研究結(jié)果基本相符合，因此在制定免疫程序時(shí)要考慮母源抗體對(duì)免疫效果的影響。免疫1組在免疫后的21 d達(dá)到最高水平，之后開(kāi)始緩慢降低，在免疫后的35 d與空白對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；免疫2組在間隔7 d后進(jìn)行二次免疫，在35 d到達(dá)最高，其抗體水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于免疫1組，免疫后7周，抗體水平依然高于免疫1組的最高水平，與空白對(duì)照組依然有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果顯示，疫苗免疫可以刺激雛鴨產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，二次免疫抗體水平要遠(yuǎn)高于一次免疫，推測(cè)可能是由于母源抗體的作用導(dǎo)致一次免疫效果的降低。

外周血T淋巴細(xì)胞在疫苗抗原的刺激下，可以提高其自身的活性，免疫1組和免疫2組的E玫瑰花環(huán)形成率明顯高于空白對(duì)照組，2個(gè)免疫組之間沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明，疫苗免疫可以提高鴨外周T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)雛鴨的細(xì)胞免疫水平。

沙門菌滅活疫苗的免疫效果不如減毒或無(wú)毒載體等口服活疫苗，但是由于沙門菌的毒力因子很多，減毒疫苗是否會(huì)發(fā)生毒力恢復(fù)或返強(qiáng)，其安全性還有待進(jìn)一步研究證實(shí)[9-10]。由于徐州及周邊地區(qū)，近年來(lái)從病鴨分離的沙門菌主要為印第安納沙門菌、阿貢納沙門菌和鴨沙門菌3種鴨源沙門菌，所以本研究以3種菌株制備多價(jià)滅活疫苗，研究結(jié)果表明，多價(jià)滅活疫苗可以對(duì)強(qiáng)毒株攻菌獲得很高的存活率，對(duì)鴨沙門菌攻毒保護(hù)率可以達(dá)到100%，對(duì)阿貢納沙門菌攻毒保護(hù)率為90%，對(duì)印第安納沙門菌及3種混合菌株的攻毒保護(hù)率可以達(dá)到87%，證明該疫苗具有實(shí)質(zhì)性的免疫預(yù)防作用，這些研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)一些研究結(jié)果是一致的[11-13]。但是，動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示存活率還有待進(jìn)一步地提高，尤其是對(duì)毒性較強(qiáng)印第安納沙門菌和多種聯(lián)合菌株的攻毒感染，因此制定合理的免疫程序和聯(lián)合免疫，以及攻毒后的聯(lián)合防制是下一步研究的重點(diǎn)工作。

本研究以徐州地區(qū)主要流行的鴨源沙門菌制備油乳滅活疫苗，其各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到要求，且安全可靠。外周血抗體檢測(cè)結(jié)果顯示二次免疫優(yōu)于單次免疫，二免抗體水平逐漸持續(xù)上升，遠(yuǎn)高于單次免疫，并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持平穩(wěn)的抗體水平；疫苗免疫可以刺激雛鴨產(chǎn)生一定程度的細(xì)胞免疫反應(yīng)，多價(jià)滅活疫苗可以有效保護(hù)鴨源沙門菌單菌株或多個(gè)混合菌株對(duì)雛鴨的感染，對(duì)動(dòng)物的保護(hù)率可以達(dá)到87%～100%。