王明金 王愛民 劉春花 張 旭 李勇軍 王永林 林昌虎*

1.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004

蓖麻葉為大戟科植物蓖麻RicinuscommunisL.的新鮮或干燥的葉。蓖麻為一年生粗壯草本或草質(zhì)灌木，高達(dá)5米；小枝、葉和花序通常被白霜，莖多液汁[1-2]。蓖麻葉味苦、辛，性平，小毒，具有清熱解毒、拔毒消腫、祛風(fēng)除濕的功效，主要用于治療風(fēng)濕麻痹、咳嗽痰喘、子宮下垂、癰瘡腫毒等，為貴州少數(shù)民族用藥[3]。據(jù)報(bào)道，蓖麻葉中含有含有生物堿、揮發(fā)油、萜類等成分[4-8]。蓖麻資源豐富，除了《中國藥典》收載的蓖麻子和蓖麻油[9]，蓖麻葉也具有良好的藥用價(jià)值和應(yīng)用前景。但是目前關(guān)于蓖麻葉的質(zhì)量控制方法尚不完善，僅收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003版中，質(zhì)量控制項(xiàng)目簡(jiǎn)單，僅有性狀鑒定。因此，本研究采用顯微鑒別法、薄層色譜(TLC)對(duì)蓖麻葉進(jìn)行定性研究，同時(shí)檢查項(xiàng)增加水分、總灰分以及浸出物，為完善蓖麻葉的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 50i顯微鏡及DS-Fi2顯微成像系統(tǒng)(日本尼康公司)； REPROSTAR3薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG)；EL204電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；AE240十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；CQ250A-TS超聲波清洗機(jī)(250 W，頻率40 kHz，上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠)；DK-98-Ⅱ型水浴鍋(天津泰斯特有限公司)；WP-ΜP-II-20實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥 水合氯醛(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，丙三醇(AR，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鉀、無水乙醇、甲醇、乙醚購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，三氯甲烷、乙酸乙酯購自上海申博化工有限公司，硫酸購自重慶川東化工(集團(tuán))有限公司，環(huán)己烷、磷鉬酸、香蘭素購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，石油醚購自科安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司，乙酸丁酯購自國營重慶無機(jī)化學(xué)試劑廠，以上試劑均為分析純；三乙胺(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；

青島海洋硅膠G板(青島海洋化工廠分廠)；煙臺(tái)江友黃海硅膠HSG板(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司)；青島鼎康硅膠G板(青島鼎康硅膠有限公司)。

11批的蓖麻葉(批號(hào)：20170816、20170816、20170901、20170902、20180701、20180715、20180720、20180722、20180726、20180801、20180803)，分別產(chǎn)自貴州貞豐，貴州貞豐，貴州平塘，貴州安順，貴州鎮(zhèn)寧，貴州金沙，貴州興義，貴州興義，貴州金沙，貴州盤州，貴州關(guān)嶺。所有藥材經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院張旭副教授鑒定為大戟科植物蓖麻RicinuscommunisL.的干燥葉，以來自鎮(zhèn)寧的樣品(批號(hào)：20180701)為對(duì)照藥材，代表性標(biāo)本保存于貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 顯微鑒別 蓖麻葉粉碎，過4號(hào)篩，挑去少許粉末置載玻片上，滴加蒸餾水、水合氯醛試液(必要時(shí)加熱透化)，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察，記錄拍照。

2.2 薄層色譜鑒別 取本品粉末1 g，加無水乙醇10 mL，冷浸20 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取蓖麻葉對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(25∶4∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以磷鉬酸試液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

2.3 水分、總灰分、水溶性浸出物測(cè)定取本品粉末(過二號(hào)篩)2 g，精密稱定，照《中國藥典》(2015版)通則0832水分測(cè)定法(第二法 烘干法)測(cè)定[10]102。

取本品粉末2 g，照《中國藥典》(2015版)通則2302 灰分測(cè)定法(總灰分測(cè)定法)測(cè)定[10]204，根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算本品中總灰分的含量(%)。

取本品粉末(過二號(hào)篩)2 g，精密稱定，置100 mL的錐形瓶中，精密加水50 mL，照《中國藥典》(2015版)通則2201浸出物測(cè)定法(水溶性浸出物測(cè)定法 熱浸法)測(cè)定[10]202，以干燥品計(jì)算本品中水溶性浸出物的含量(%)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 顯微鑒別結(jié)果 經(jīng)過對(duì)多批蓖麻葉進(jìn)行粉末鑒別試驗(yàn)，對(duì)其特有的結(jié)構(gòu)進(jìn)行總結(jié)，其粉末顯微結(jié)構(gòu)如圖1所示，本品粉末為深綠色。葉表皮細(xì)胞呈不規(guī)則形狀，氣孔呈平軸式，直徑21～23 μm；導(dǎo)管多為螺紋，直徑3～42 μm；草酸鈣簇晶較多，直徑9～39 μm，有的簇晶排列成行；晶鞘纖維多，直徑8～14 μm；纖維散在，直徑7～23 μm，壁厚，紋孔明顯。

3.2 薄層鑒別結(jié)果

3.2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 照上述2.2的方法對(duì)蓖麻葉進(jìn)行薄層色譜鑒別。結(jié)果如圖2所示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置處，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

3.2.2 耐用性試驗(yàn)

3.2.2.1 不同品牌硅膠G板考察結(jié)果 為了評(píng)價(jià)該方法的實(shí)用性和可靠性，按擬定色譜條件，分別考察青島海洋硅膠G板、煙臺(tái)江友黃海硅膠HSG板和青島鼎康硅膠G板的展開效果。結(jié)果如圖3所示，上述三種品牌硅膠G薄層色譜板均能較好的對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行分離。

3.2.2.2 不同展開溫度的考察 按擬定色譜條件，分別在20℃、25℃、35℃下展開，相對(duì)濕度為50%下展開，考察不同溫度對(duì)展開的影響。結(jié)果如圖4所示，不同溫度下供試品色譜中，各個(gè)斑點(diǎn)清晰，溫度在20～35℃均能較好的鑒別蓖麻葉，說明溫度對(duì)該方法的展開結(jié)果影響不大。

3.2.2.3 不同展開濕度的考察 按擬定色譜條件，分別在濕度30%、50%、70%下展開，考察不同相對(duì)溫度對(duì)展開的影響。結(jié)果如圖5所示，各斑點(diǎn)顯示清晰，相對(duì)濕度在30%～70%之間均能較好的鑒別蓖麻葉，說明相對(duì)濕度對(duì)該方法下的試驗(yàn)結(jié)果影響不大。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 每天制備一份供試品溶液，連續(xù)3 d，室溫保存，在第4天再分別制備一份供試品溶液和對(duì)照藥材溶液，將不同放置時(shí)間的供試品溶液點(diǎn)于同一硅膠G板上，展開，顯色，以考察供試品溶液的穩(wěn)定性。對(duì)穩(wěn)定性考察結(jié)果如圖6所示，供試品溶液在室溫下放置72 h穩(wěn)定性良好。

2.2.4 樣品鑒別結(jié)果 以鎮(zhèn)寧(批號(hào)20180701)為對(duì)照藥材，照建立的薄層色譜鑒別方法對(duì)所收集的10批蓖麻葉鑒別結(jié)果如圖7所示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材相同位置處，顯示相同顏色的斑點(diǎn)。

3.3 水分、總灰分、水溶性浸出物測(cè)定結(jié)果 照2.3項(xiàng)下方法測(cè)定水分、總灰分、水溶性浸出物，分別計(jì)算結(jié)果，結(jié)果見表1。11批干蓖麻葉水分平均含量范圍為9.69%～13.8%，平均值為13.85%；總灰分含量范圍為8.53%～12.12%，平均值為10.39%；水溶性浸出物含量范圍為16.34%～24.48%，平均值為20.51%。

表1 干蓖麻葉水分、總灰分和水溶性浸出物測(cè)定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

3.1 顯微鑒別方法的考察 中藥鑒定方法有傳統(tǒng)鑒定方法和新技術(shù)方法，性狀鑒定、來源鑒定、理化鑒定、顯微鑒定是傳統(tǒng)中藥鑒定的主要四類方法，其中顯微鑒定是目前中藥鑒別的主要方法之一[11-12]。中藥顯微鑒定是應(yīng)用顯微技術(shù)對(duì)中藥進(jìn)行分析或鑒定，即應(yīng)用顯微鏡對(duì)中藥材的組織、細(xì)胞或內(nèi)含物等特征進(jìn)行鑒別的一種鑒別方法[13]。此次試驗(yàn)鑒定的為蓖麻葉，屬于葉類中藥，大部分根、莖、葉、花、果實(shí)、根皮、莖皮類均可采用粉末制片法[14]，因此采用粉末制片法對(duì)蓖麻葉進(jìn)行顯微鑒定，該方法簡(jiǎn)單、快速，能清晰有效地觀察到蓖麻葉粉末中的特征顯微結(jié)構(gòu)，能有效的鑒定蓖麻葉。

3.2 提取條件及展開系統(tǒng)的考察 薄層色譜法是在合適大小的玻璃板上，將硅膠、氧化鋁、聚酰胺鍵等吸附劑制成的固定相均勻的鋪在板上，然后將樣品溶液點(diǎn)于薄層板上，在適當(dāng)?shù)恼归_容器中用合適的展開溶劑展開，當(dāng)展開到適當(dāng)距離時(shí)取出，顯色，最后將所得色譜圖同標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按同法所得的色譜圖比較，用于定性、定量試驗(yàn)[15-16]。此次試驗(yàn)通過對(duì)不同提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間等因素的考察，確定最佳提取條件為本品粉末1 g，加無水乙醇10 mL,冷浸20 min，濾過，取濾液作為供試品溶液，該方法簡(jiǎn)單易行。同時(shí)考察了不同展開劑和檢視方法，確定以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(25∶4∶0.1)為最終的展開系統(tǒng)，以磷鉬酸試液為顯色劑，結(jié)果顯示分離度好，斑點(diǎn)清晰。同時(shí)對(duì)不品牌的薄層色譜板、不同溫度、不同濕度，穩(wěn)定性進(jìn)行考察，結(jié)果顯示該方法可靠、穩(wěn)定，最終用于11批樣品的鑒定，均能較好的鑒定各批蓖麻葉藥材。

3.3 小結(jié) 本研究所建立的蓖麻葉質(zhì)量控制方法具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定和可靠的特點(diǎn)，顯微鏡下觀察到氣孔為平軸式，導(dǎo)管為螺紋，草酸鈣簇晶存在于葉肉薄壁細(xì)胞中，晶鞘纖維多，纖維散在，同時(shí)測(cè)量了各組織的直徑，以上特征均可作為鑒定蓖麻葉粉末特征的依據(jù)；薄層色譜結(jié)果顯示主斑點(diǎn)顯示清晰，且各斑點(diǎn)之間分離度良好，在相同位置與對(duì)照藥材顯示相同顏色的斑點(diǎn)，由此進(jìn)一步說明所建立的方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好，適用于蓖麻葉的鑒別；水分、總灰分、浸出物結(jié)果顯示11批蓖麻葉水分平均含量范圍9.69%～13.8%，平均含量為13.85%；總灰分平均含量范圍為8.53%～12.12%，平均含量為10.39%；浸出物平均含量范圍為16.34%～24.48%，平均含量為20.51%。因此可暫定水分、總灰分、浸出物分別不得超過15%、13%、18%。11批蓖麻葉的水分、總灰分、浸出物含量存在差異可能與藥材的不同產(chǎn)地、不同氣候氣候、采收時(shí)間有關(guān)。綜上，本實(shí)驗(yàn)較為系統(tǒng)的研究了蓖麻葉質(zhì)量控制方法，并且該方法穩(wěn)定、簡(jiǎn)便可靠，能為蓖麻葉的質(zhì)量控制提供依據(jù)。