黃 寬 林艾和 范 源,2*

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650216

三果湯又名哲布湯，由訶子(Terminaliachebula)、毛訶子(Terminaliabellirica)和余甘子(Phyllanthusemblica)3味藥組成，為藏醫(yī)中重要的基礎(chǔ)方，《四部醫(yī)典》中記載，其具有治療瘟疫、紊亂熱癥、促使熱癥成型的作用[1]?，F(xiàn)代研究表明，三果湯主要含鞣質(zhì)酚酸類成分[2]，具有抗菌[3]、抗炎[4-5]、抗腫瘤[6-7]、抗氧化[8]、抗輻射[9]、降糖[10]、降脂[11]、肝腎損傷的保護(hù)[12-13]等藥理作用。沒食子基兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate，GCG)、表沒食子基兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)為兒茶素類物質(zhì)，具有抗氧化、降脂、抗腫瘤、抗血栓等作用以及清除自由基活性等[14-18]。目前，尚無對三果湯中這兩個(gè)成分進(jìn)行定量分析的報(bào)道，為更全面地評價(jià)三果湯的質(zhì)量，本研究建立建立新的HPLC方法對三果湯中EGCG和GCG成分的含量進(jìn)行定量測定。

1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，色譜柱為 Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機(jī)(永康式速鋒工貿(mào)有限公司)；T-1000型電子天平(上海浦春計(jì)量儀器有限公司)；AB265-SMETTLER TOLEDO十萬分之一分析天平(Mettler-tolido international trade(Shanghai) co.LTD)。

表沒食子基兒茶素沒食子酸酯(EGCG批號(hào)：wkq20051208，四川省維克奇生物科技有限公司)、沒食子基兒茶素沒食子酸酯(GCG批號(hào)：wkq20051403，四川省維克奇生物科技有限公司)；訶子、毛訶子、余甘子(批號(hào)：20190803，安國市旭芳中藥材經(jīng)營有限公司)。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Zorbax C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～8 min，8%～10% A；8 ～20 min，10%～15% A；20～50 min，15%～30% A；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按EGCG計(jì)算應(yīng)不低于5000，分離度均大于1.5。色譜圖如圖1所示。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取EGCG、GCG對照品2.31 mg、0.84 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇配制成EGCG、GCG濃度分別為0.2310 mg·mL-1和0.0840 mg·mL-1的混合對照品溶液。放置于4℃冰箱保存，臨用時(shí)放置至室溫。

2.2.2 供試品溶液 根據(jù)傳統(tǒng)藏醫(yī)藥中三果湯處方配比，訶子、毛訶子和余甘子3種藥材去核后按1∶1∶1的比例水煎制得[19]，稱取取訶子、毛訶子、余甘子藥材(去核)各1.0 g，搗碎，加入100 mL餾水，浸泡30 min，煎煮3次，每次20 min，過濾，合并3次濾液，濃縮定容至50 mL容量瓶中，冷藏備用。制備成含生藥0.5 g·mL-1的三果湯水提物，吸取備用三果水提物1 mL，加50%甲醇定容于10 mL容量瓶中，用0.45 μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾處理，即得到樣品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密稱取EGCG、GCG對照品11.55 mg、4.20 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇配制成EGCG、GCG濃度分別為0.2310 mg·mL-1和0.0840 mg·mL-1的混合對照品儲(chǔ)備液。精密吸取混合對照品儲(chǔ)備液各1、2、4、6、8、10 mL于10 mL量瓶中，分別加甲醇稀釋，得到EGCG分別為0.0231、0.0462、0.0924、0.1386、0.1848、0.2310 mg·mL-1；GCG分別為0.00840、0.0168、0.0336、0.0504、0.0672、0.084 mg·mL-1的6份不同質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液，精密吸取上述各溶液10 μL進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(mAU*s)為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸分析。EGCG回歸方程為Y=1391.4X-23.937，r=0.9996，表明EGCG在0.0231～0.2310 mg·mL-1范圍內(nèi)EGCG的峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。GCG回歸方程為Y=3489.7X-59.47，r=0.9991，表明GCG在0.0084～0.0840 mg·mL-1范圍內(nèi)GCG的峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示EGCG、GCG峰面積RSD分別為0.53%、0.67%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下，分別于2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，結(jié)果顯示EGCG、GCG在10 h內(nèi)峰面積的RSD值分別為0.91%、1.14%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批訶子、毛訶子、余甘子藥材6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取6份供試品溶液各10 μL進(jìn)樣，結(jié)果顯示EGCG、GCG平均含量為12.26 mg/g、5.23 mg/g， RSD分別為1.51%、1.47%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取9份已知含量的訶子、毛訶子、余甘子藥材各0.5 g，按1∶1∶1配制成三果湯，分別按照藥材含有量的80%、100%、120%加入混合對照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣。結(jié)果見表2。其中，供試品溶液以10 μL進(jìn)樣分析，測得EGCG和GCG均在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。

表2 加樣回收率試驗(yàn) (n=9)

續(xù)表2 表2 加樣回收率試驗(yàn) (n=9)

2.8 含量測定 取6份不同批次三果湯樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下條件下進(jìn)樣，計(jì)算EGCG和GCG成分含有量，結(jié)果見表3。

表3 含量測定結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)分別對不同流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察，乙腈(甲醇)-0.1%磷酸、乙腈(甲醇)-0.2%磷酸等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液作流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，分離度較好且峰形尖銳。同時(shí)對柱溫(25、30、35℃)和流速(0.85、1.0、1.25、1.5 mL·min-1)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，柱溫25 ℃、流速 1.0 mL·min-1時(shí)分離效果好。本研究以EGCG和GCG作為三果湯水提物質(zhì)量控制指標(biāo)，建立了HPLC同時(shí)測定三果湯水提物中EGCG和GCG含量的方法。該方法簡便可行，結(jié)果準(zhǔn)確，可有效控制三果湯水提物的質(zhì)量，為藏藥三果湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供基礎(chǔ)。