郭金洲 陳海寧 馬晶鑫 田維毅 蔡 琨

貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽 550000

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是多因素共同作用引起的疾病，雖然其發(fā)病機(jī)制尚不明確。但研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是AS發(fā)生發(fā)展的重要因素[1]，而ROS蓄積增多引起的血管內(nèi)皮氧化損傷是 AS發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2-3]。

G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G protein-coupled estrogen receptor,GPER/GPR30)作為一種新型的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)雌激素膜受體[4]，在雌激素非基因組效應(yīng)中發(fā)揮主要作用[5]。有報(bào)道稱，通過調(diào)節(jié)GPR30降低動脈粥樣硬化的發(fā)生[6]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮(soy isoflavones,SIF)具有良好的抗氧化損傷作用[7-8]，SIF是植物雌激素的一種，具有類雌激素作用。因此我們推測大豆異黃酮可能通過GPR30介導(dǎo)的類雌激素效應(yīng)降低內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷。為驗(yàn)證我們的猜想，實(shí)驗(yàn)選用ox-LDL誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞構(gòu)建內(nèi)皮氧化損傷模型，使用SIF干預(yù)損傷模型，觀察其抗氧化作用，并觀察使用GPR30受體拮抗劑G-15干預(yù)后，SIF抗氧化損傷效應(yīng)的變化，進(jìn)而探討SIF抗氧化損傷及其與GPR30的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞融合細(xì)胞(Human umbilical vein cell fusion cell，EA.hy926),購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(編號：KCB2014049YJ)。

1.1.2 試劑與儀器 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物有限公司； ox-LDL購自廣州奕源有限公司；RIPA裂解液購自索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑購自尚寶生物科技有限公司；ET-1Elisa試劑盒購自深圳子科；LDH檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒均購自南京建成有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自BIO-RAD公司；RNA提取試劑盒購自Thermo公司；PrimeScriptTM RTreagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH PLUS)購自Takara公司；β-actin antibody、山羊抗兔熒光Ⅱ抗購自Absin公司；GPR30 antibody購自購自CST公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀購自Therom公司；倒置顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理 取對數(shù)生長期的EA.hy926細(xì)胞，隨機(jī)分為：空白對照組(Control)、模型組(ox-LDL)、雌二醇組(E2)、大豆異黃酮組(SIF)、GPR30受體拮抗劑組(G-15)。模型組加入終濃度40 mg·L-1ox-LDL ；雌二醇組、大豆異黃酮組在加入ox-LDL 的同時再分別給予終濃度為10 μmol·L-1E2和80 μg·L-1SIF，GPR30受體拮抗劑組預(yù)先使用10-7mol·L-1G-15干預(yù)2 h，然后加入終濃度40 mg·L-1ox-LDL和80 μg·L-1SIF，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.2 CCK-8檢測細(xì)胞存活率 將細(xì)胞以5×103個/孔，接種于96孔板中，分組及處理方式參照2.1進(jìn)行，干預(yù)結(jié)束后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入90 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基和10μL CCK-8試劑，孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長測定各孔吸光值(OD)并計(jì)算細(xì)胞存活率，并按試劑說明書公式計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.2.3 LDH、ET-1檢測 取對數(shù)生長期的EA.hy926細(xì)胞以1×106個/孔，接種于T25瓶中，按照2.1分組并處理細(xì)胞，吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清，分裝于1.5 mLEP管中，于-20 ℃保存。細(xì)胞上清中LDH、ET-1檢測參照各自試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 SOD、MDA的檢測 按照2.3收集細(xì)胞培養(yǎng)上清后，使用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2次，加入適當(dāng)預(yù)冷PBS于冰上使用細(xì)胞刮刀，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)存于1.5 mLEP管中，1000×g，4 ℃離心5 min，棄上清后，加入含有1%蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，超聲粉碎后，于冰上裂解30 min，12000×g，4 ℃離心取上清，即得細(xì)胞蛋白，采用BCA法測定各組蛋白含量。SOD、MDA檢測參照各試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 qRT-PCR檢測 HO-1 mRNA表達(dá)水平

按RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA的提取，RNA樣品以O(shè)D260/OD280的比值在1.8～2.0之間為佳。RNA反轉(zhuǎn)錄按試劑盒進(jìn)行，cDNA保存在-20 ℃。以cDNA作為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系及條件見表1。按2-ΔΔct法計(jì)算各基因相對表達(dá)水平。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，序列見表2。

表1 Real time PCR試劑配制

表2 引物序列

1.2.6 Western Blot檢測GPR30蛋白表達(dá) 細(xì)胞核蛋白提取按照核蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行，細(xì)胞總蛋白提取及蛋白定量參照1.2.4進(jìn)行，蛋白上樣量統(tǒng)一為30 μg，使用10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)法于冰上轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉封閉，分別加入一抗GPR30(1∶300)β-actin(1∶1000)，4℃孵育過夜。用TBST洗滌3次，加入二抗(1∶10000)室溫孵育1h,用TBST洗滌3次。采用ECL顯色，使用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 不同處理方式對EA.hy926細(xì)胞存活率的影響 模型組細(xì)胞存活率較空白組顯著下降(P<0.01)；E2和SIF干預(yù)的細(xì)胞存活率較模型組顯著增高(P<0.01),拮抗GPR30受體后，SIF干預(yù)細(xì)胞存活率與模型組相比無差異，與E2和SIF干預(yù)組相比細(xì)胞存活率顯著下降。結(jié)果見表3。

表3 各藥物對EA.hy926細(xì)胞存活率的影響

3.2 不同處理方式對EA.hy926細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH、ET-1影響 與空白組相比，模型組、雌二醇組和大豆異黃酮組細(xì)胞上清中LDH活性、ET-1顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，雌二醇組和大豆異黃酮組，細(xì)胞上清中LDH活性、ET-1水平明顯降低均有顯著性差異(P<0.01);GPR30受體拮抗劑組與大豆異黃酮組相比，細(xì)胞上清中LDH活性、ET-1顯著升高(P<0.01)。結(jié)果如圖1所示。

注：A.各組LDH活性;B.各組ET-1水平；與正常組比較，**P<0.01;與模型組比較, ##P<0.01；與大豆異黃酮組比較,△△P<0.01。

3.3 不同處理方式對EA.hy926細(xì)胞中SOD、MDA影響 與空白組相比，模型組細(xì)胞SOD活力有顯著下降(P<0.01)MDA水平均顯著升高(P<0.01)，雌二醇組和大豆異黃酮組SOD活力、MDA水平亦無顯著性差異;與模型組相比，雌二醇組和大豆異黃酮組細(xì)胞SOD活力有顯著升高(P<0.01)MDA水平均顯著下降(P<0.01)；與雌二醇組組相比，大豆異黃酮組SOD活力及MDA水平無顯著性差異；GPR30受體拮抗劑組與大豆異黃酮組相比，細(xì)胞SOD活力顯著下降(P<0.01)MDA水平均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，SOD活力及MDA水平無顯著性差異。結(jié)果如圖2所示。

注：A 各組SOD活性；B各組MDA含量；與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較, ##P<0.01;與大豆異黃酮組比較,△△P<0.01。

3.4 各組細(xì)胞中HO-1 mRNA表達(dá)水平 與空白組相比，模型組、雌二醇組和大豆異黃酮HO-1 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01);與模型組相比，雌二醇組和大豆異黃酮組HO-1 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與雌二醇組組相比，大豆異黃酮組HO-1 mRNA表達(dá)無顯著性差異；GPR30受體拮抗劑組與大豆異黃酮組相比，HO-1 mRNA表達(dá)顯著顯著下降(P<0.01)。結(jié)果見表4。

表4 各藥物對HO-1 mRNA表達(dá)的影響

3.5 各組細(xì)胞中GPR30受體蛋白表達(dá)情況 正常組細(xì)胞中，GPR30蛋白表達(dá)較低，在ox-LDL干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)GPR30蛋白表達(dá)顯著增多，與正常組相比增多具有顯著性差異；ox-LDL分別與雌二醇和大豆異黃酮共同干預(yù)后，與正常組相比，GPR30蛋白表達(dá)顯著增多，與模型組相比，GPR30受體蛋白表達(dá)明顯降低；使用GPR30特異性阻斷劑G-15預(yù)先處理后，ox-LDL和大豆異黃酮共同干預(yù)，GPR30蛋白表達(dá)與正常組相比，無顯著差異，與大豆異黃酮組相比，顯著下降。結(jié)果如圖5所示。

注：與正常組比較，**P<0.01;與模型組比較, #P<0.05、##P<0.01；與大豆異黃酮組比較,△△P<0.01。

4 討論

ROS氧化修飾低密度脂蛋白(LDL)生成的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)[9]可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞中g(shù)p91吞噬細(xì)胞氧化酶表達(dá)增加，使NADPH氧化酶活性增強(qiáng)進(jìn)而導(dǎo)致ROS生成增多[10]，引起血管內(nèi)皮氧化損傷并進(jìn)一步導(dǎo)致AS發(fā)生發(fā)展。在本次實(shí)驗(yàn)中，使用ox-LDL干預(yù)EA.hy926細(xì)胞后，細(xì)胞生存率明顯下降，并出現(xiàn)了明顯的氧化損傷，證明模型制備成功。

女性絕經(jīng)后，LDL-C水平急劇上升，而HDL-C水平則適度下降。同樣，HDL-C的下降伴隨著apoA-I水平的升高，進(jìn)而導(dǎo)致動脈粥樣硬化和CAD發(fā)病率和死亡率升高，因此，有理由推測內(nèi)源性腺激素起到了重要作用[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，SIF可影響女性激素水平，其作為植物雌激素的一種，具有類雌激素作用，同時也是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，對心血管疾病表現(xiàn)出良好的積極作用[13]。本次研究結(jié)果中，盡管SIF組中的LDH活性和ET-1水平相比正常組明顯升高，但相比于模型組細(xì)胞，SIF可以顯著提高其存活率，并且增加了抗氧化酶SOD的活性以及抗氧化化酶HO-1的mRNA表達(dá)水平，氧化損傷指標(biāo)顯著降低。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SIF降低氧化損傷的作用效果與雌二醇效果相當(dāng)。使用雌二醇干預(yù)氧化損傷引起的動脈粥樣硬化在臨床應(yīng)用中已早有報(bào)道，但有報(bào)道稱，長期暴露于大劑量雌二醇中會引起惡性癌癥[14]發(fā)生。同時有研究[15]表明，染料木素可降低由雌二醇引起的內(nèi)皮損傷。SIF主要物質(zhì)為染料木素、大豆黃素等，因此，筆者認(rèn)為SIF在起到雌激素作用的同時，或許還可以降低雌激素過量引起的機(jī)體損傷。這為SIF在臨床中作為雌激素的替代品或作為應(yīng)用雌激素時的輔助品提供了可能。

G蛋白偶聯(lián)雌激素受體GPR30在二十年前的人類乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，隨后在許多其他細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。有報(bào)道稱，GPR30無處不在，具有多種生物學(xué)作用，包括調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，免疫，神經(jīng)元和心血管功能[16]，以往的實(shí)驗(yàn)[17]發(fā)現(xiàn)，GPR30可以減少絕經(jīng)后的動脈粥樣硬化和炎癥的發(fā)生，揭示了GPR30的抗動脈粥樣硬化功能。有研究[18]表明，雌二醇可通過GPR30預(yù)防動脈粥樣硬化的發(fā)生。因此，筆者推測具有類雌激素作用的SIF或許可以作用于心血管系統(tǒng)中的GPR30受體降低內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，并進(jìn)一步降低動脈粥樣硬化的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在使用GPR30受體特異性阻斷劑干預(yù)后，SIF降低內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用顯著降低，這也證實(shí)了筆者的推測。但有趣的是，在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，正常組細(xì)胞GPR30蛋白表達(dá)很低，但在ox-LDL引起氧化損傷后，GPR30表達(dá)顯著升高，或許二者之間存在著某種特殊關(guān)系，本次實(shí)驗(yàn)并未深入研究，這或?qū)⒊蔀榻酉聛淼年P(guān)注重點(diǎn)。但GPR30受體特異性阻斷后，與SIF組相比GPR30蛋白表達(dá)顯著降低，這至少證明了GPR30受體在SIF抗氧化損傷中起著重要作用。

綜上，筆者認(rèn)為SIF對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有抗氧化損傷的作用，并可能是通過調(diào)節(jié)GPR30受體完成。不足之處，在于本研究僅僅通過體外實(shí)驗(yàn)證明了GPR30拮抗在SIF降低氧化損傷的中作用，對其深層的作用機(jī)制未涉及，這將會是接下來的工作重點(diǎn)。