丁博群，劉珊娜

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300392）

隨著生活水平的提高，人們對(duì)食品的質(zhì)量安全關(guān)注度逐漸增強(qiáng)。傳統(tǒng)的食品檢測方法耗時(shí)較長，無法滿足市場的需求，發(fā)展食品快速檢測技術(shù)成為必然趨勢?？焖贆z測是指實(shí)驗(yàn)樣品前處理簡單、所用試劑較少、制備后可較長時(shí)間保存、操作簡便、對(duì)操作人員要求較低且能夠在較短時(shí)間內(nèi)完成檢測分析并得出結(jié)果的檢測方法[1]。此方法可以快速篩查存在問題的產(chǎn)品，及時(shí)避免生產(chǎn)企業(yè)的損失和食品安全事件的發(fā)生。目前常用到的快速檢測技術(shù)有化學(xué)比色法、酶抑制法、免疫分析技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、生物芯片技術(shù)、生物傳感器技術(shù)等[1]。本文分析了以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（realtime quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技術(shù)在食品快速檢測中的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用熱點(diǎn)，為完善食品快速檢測體系提供參考。

1 熒光定量PCR的基本原理及發(fā)展歷程

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）又稱為PCR技術(shù)，是一種在生物體外把少量初始樣品中的目的基因DNA片段進(jìn)行大量擴(kuò)增的核酸合成技術(shù)。熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技術(shù)是在PCR過程中引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物不斷增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)收集到一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化來監(jiān)測產(chǎn)物量的變化從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性分析[2-3]。擴(kuò)增曲線一般分為停滯期、指數(shù)增長期和飽和期，由于只有指數(shù)增長期的擴(kuò)增曲線是存在線性關(guān)系的，所以選擇在這一時(shí)期進(jìn)行分析[4]。與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR采用光譜檢測，避免了耗時(shí)的凝膠電泳，更加快速便捷，提高了檢測的準(zhǔn)確性、靈敏性和特異性[5]。1992年熒光定量PCR技術(shù)被首次報(bào)道[6]，隨后，SYBR Green染料、Eva Green染料、TaqMan探針、分子信標(biāo)等均出現(xiàn)在熒光定量PCR的應(yīng)用中。1999年Va?tilingom等[7]通過熒光定量PCR技術(shù)測定食品中的轉(zhuǎn)基因玉米和大豆，這是熒光定量PCR首次報(bào)道應(yīng)用于食品檢測中。二十一世紀(jì)以來，熒光定量PCR技術(shù)逐漸開始應(yīng)用于檢測食品中致病菌、摻雜摻假、過敏原、寄生蟲、抗性基因、可食用昆蟲等。近年來，又出現(xiàn)了將熒光定量PCR技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合的檢測手段，比如采用免疫磁分離與qPCR結(jié)合的方法快速檢測大腸桿菌[8]；采用疊氮溴化丙錠（PMA）與qPCR聯(lián)合的方法檢測生菜中的沙門氏菌[9]；基于GNM C7-8 qPCR系統(tǒng)對(duì)8種食源性致病菌進(jìn)行檢測分析[10]；利用芯片與qPCR結(jié)合的技術(shù)鑒別羊肉摻雜摻假[11]；將微生物分子檢測儀與qPCR結(jié)合對(duì)食品中沙門氏菌進(jìn)行檢測[12]；建立了熒光定量PCR技術(shù)與微滴數(shù)字PCR技術(shù)結(jié)合的檢測方法用于精確定量肉制品中的羊肉成分[13]。除此之外還有一些在試劑盒上的改進(jìn)，比如王斌[14]研發(fā)了一種帶有無需電路結(jié)構(gòu)和額外照明光源即可發(fā)出與熒光試劑相同熒光色并達(dá)到指示效果的自發(fā)光指示燈管，使熒光定量PCR技術(shù)可以在更多樣的環(huán)境下應(yīng)用，操作更加便利。

2 熒光定量PCR的分類

2.1 熒光染料法

常用的熒光染料包括SYBR GreenⅠ、Eva Green和Pico Green等，其中SYBR GreenⅠ應(yīng)用最為廣泛[15]。SYBR GreenⅠ不結(jié)合單鏈的DNA，游離狀態(tài)下不受激發(fā)，無信號(hào)檢測，能選擇性地與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，其信號(hào)強(qiáng)度與體系中的雙鏈DNA含量成正比。SYBR GreenⅠ的最大優(yōu)勢在于可用于監(jiān)測雙鏈DNA序列的擴(kuò)增，對(duì)DNA模板沒有選擇性，通用性強(qiáng)，使用方便，不需要設(shè)計(jì)和合成復(fù)雜的探針，靈敏度高，價(jià)格便宜。但是SYBR GreenⅠ會(huì)與體系中非特異性的雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生假陽性的信號(hào)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[16]。

2.2 熒光探針法

熒光探針法分為水解探針和雜交探針兩種。TaqMan探針是最常見也是應(yīng)用最廣泛的水解探針，可以與互補(bǔ)靶序列進(jìn)行特異性結(jié)合。其5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，3’端的熒光淬滅基團(tuán)可以吸收5’端的報(bào)告熒光基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量，檢測不到報(bào)告熒光基團(tuán)的信號(hào)；而在PCR延伸時(shí)，熱穩(wěn)定DNA聚合酶5’端→3’端的核酸外切酶活性將熒光探針降解，報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離，就可以檢測到報(bào)告基團(tuán)的熒光[17-18]。TaqMan探針檢測的是累積熒光，它的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增量有關(guān)。TaqMan探針的優(yōu)勢在于特異性高，引物設(shè)計(jì)相對(duì)簡單，重復(fù)性好；局限性表現(xiàn)在只適合特定的目標(biāo)，熒光探針不能自行標(biāo)記，合成價(jià)格較高。雜交探針中應(yīng)用最多的是分子信標(biāo)[4]。分子信標(biāo)是一個(gè)呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的閉合環(huán)狀雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端分別標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，初始階段兩端的堿基互補(bǔ)配對(duì)，稱為莖狀區(qū)，目的基因擴(kuò)增時(shí)，莖狀區(qū)在加熱條件下解鏈由環(huán)狀變?yōu)殒湢睿康幕蚺c原來的環(huán)狀區(qū)特異性結(jié)合，報(bào)告熒光基團(tuán)被激發(fā)釋放熒光[4,19-20]。

3 熒光定量PCR技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用領(lǐng)域

3.1 食源性致病菌的檢測

目前，熒光定量PCR技術(shù)在食源性致病菌的檢測方面應(yīng)用廣泛，相對(duì)其他方面較為成熟，已有在多種類型食品中檢測不同致病菌的研究報(bào)道。表1總結(jié)了近年來部分研究情況，其中TaqMan探針法使用相對(duì)較多。

3.1.1 肉制品中食源性致病菌的檢測 肉制品中蛋白質(zhì)和脂類等營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，存在化學(xué)性污染和生物性污染等風(fēng)險(xiǎn)。肉制品中常見的食源性致病菌主要包括沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、志賀氏菌等。楊旭[31]使用免疫磁分離與兩重?zé)晒舛縋CR相結(jié)合的快速檢測方法對(duì)鮮豬肉中金黃色葡萄球菌和志賀氏菌進(jìn)行檢測分析，檢測可在6 h內(nèi)完成，金黃色葡萄球菌的檢測限為2.52CFU/g，志賀氏菌的檢測限為1.36 CFU/g。楊滴等[37]采用熒光定量PCR技術(shù)的TaqMan探針法對(duì)肉制品中蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行分析檢測，最低檢出限為1 ×103CFU/mL，同時(shí)具有較高的特異性和靈敏度。王遠(yuǎn)洋等[40]對(duì)釀膿鏈球菌進(jìn)行熒光定量PCR檢測分析，為食品中釀膿鏈球菌的檢測提供了靈敏度高、特異性強(qiáng)、高效便捷的參考方法。

3.1.2 水產(chǎn)品中食源性致病菌的檢測 水產(chǎn)品的食品安全性常常會(huì)因糞便或生活廢水等污染而受到影響，除此之外，在加工、貯藏、運(yùn)輸、銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)的操作不當(dāng)或衛(wèi)生要求不達(dá)標(biāo)，水產(chǎn)品也有可能會(huì)被致病菌污染。吳孟娟[41]利用免疫磁珠捕獲與熒光定量PCR聯(lián)合技術(shù)建立對(duì)水產(chǎn)品中河弧菌的快速檢測方法。Miotto等[27]建立了用PMA與熒光定量PCR聯(lián)合的方法檢測牡蠣中存活的大腸桿菌。

表1 熒光定量PCR在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用情況Table 1 Application of real-time qPCR in the detection of food-borne pathogens

3.1.3 乳制品中食源性致病菌的檢測 乳制品營養(yǎng)豐富并且容易被人體消化吸收，因此也存在被致病菌污染風(fēng)險(xiǎn)[42]。不僅養(yǎng)殖環(huán)境、母體本身會(huì)對(duì)乳制品中的致病菌數(shù)量產(chǎn)生影響，在工人擠奶操作和生產(chǎn)加工的過程中滅菌是否徹底以及儲(chǔ)運(yùn)銷售過程中交叉污染等均會(huì)對(duì)乳制品的食品安全性造成影響。Demirci等[30]應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)來自48頭奶牛、65只山羊、65只綿羊和53頭驢的231份生乳樣品中的沙門氏菌和志賀氏菌進(jìn)行了研究。林碧蓮等[32]建立了多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測嬰幼兒奶粉中的沙門氏菌、克羅諾桿菌和金黃色葡萄球菌的方法，姚笛等[34]利用熒光定量PCR檢測方法對(duì)牛乳中的沙門氏菌進(jìn)行檢測。郭夢冉等[36]建立了熒光定量PCR對(duì)乳制品中金黃色葡萄球菌檢測的方法，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證檢出限為3.5 CFU/mL，并且可以快速檢測乳制品中的金黃色葡萄球菌。

3.1.4 即食食品中食源性致病菌的檢測 即食食品容易在加工或貯藏運(yùn)輸?shù)倪^程中被致病菌侵染從而威脅到消費(fèi)者的身體健康，其中單增李斯特菌的侵染非常普遍。據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示，我國即食食品被單增李斯特菌侵染的比率為1%～6%[43]。鮮切果蔬作為即食食品更容易被致病菌污染，鮮切果蔬中常見的食源性致病菌包括大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏桿菌屬等[44]。關(guān)棣鍇等[22]對(duì)超市中售賣的鮮切伊麗莎白甜瓜中的單增李斯特菌進(jìn)行熒光定量PCR檢測，其檢出限為6.28×102CFU/mL。葉欣[45]對(duì)即食肉制品和果蔬中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行熒光定量PCR檢測，避免了細(xì)胞培養(yǎng)的過程，大大提高了檢測速度和效率。郭薔等[46]建立了一種可以快速檢測蔬菜中沙門氏菌的熒光定量PCR的方法，檢出限為18 CFU/mL，準(zhǔn)確率高達(dá)90%，應(yīng)用該方法對(duì)從農(nóng)貿(mào)市場獲取的60份新鮮蔬菜樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明其中5份樣品含有沙門氏菌，檢出率為8.33%。

標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法、常規(guī)PCR和熒光定量PCR在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用比較見表2。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)檢測方法需要?jiǎng)澗€培養(yǎng)、染色鏡檢、平板計(jì)數(shù)等，步驟繁瑣，耗時(shí)較長，但是操作簡單，成本低，不需要特殊儀器，也不需要專門培訓(xùn)專業(yè)技術(shù)人員。常規(guī)PCR比標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)檢測方法速度更快，靈敏度更高，需要PCR儀和凝膠電泳，成本較高，速度較快，但是提取DNA時(shí)無法判斷菌體是否死亡，還有可能提取的過程中會(huì)被抑制PCR進(jìn)程的物質(zhì)污染，或者發(fā)生提取不完全等情況，均可能對(duì)檢測結(jié)果造成誤差。熒光定量PCR比常規(guī)PCR更敏感、更準(zhǔn)確，并且反應(yīng)環(huán)境相對(duì)封閉，減少了被污染的可能性，不需要凝膠電泳，操作步驟相對(duì)較少，檢測時(shí)間短、速度快，但是需要培訓(xùn)專業(yè)技術(shù)人員，而且熒光定量PCR儀和探針價(jià)格較貴，檢測成本高。

3.2 食品摻雜摻假的檢測

3.2.1 肉制品中摻雜摻假的檢測 近年來有學(xué)者應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)肉制品的摻雜摻假作了研究。Chen等[50]在線粒體細(xì)胞色素b基因片段中設(shè)計(jì)了物種特異性引物和探針，建立了定量檢測肉制品中牛源性成分的熒光定量PCR方法，結(jié)果表明該引物和探針對(duì)肉制品中的牛源性成分具有特異性，絕對(duì)檢出限為0.025 ng DNA，陽性樣品相對(duì)檢出限為0.002%（w/w），該方法在實(shí)際應(yīng)用中具有良好的穩(wěn)定性、特異性和敏感性。Tan等[51]建立了一種優(yōu)化的DNA提取方法與SYBR Green染料熒光定量PCR結(jié)合的檢測試劑盒，用于快速檢測肉制品中的豬源性成分，在DNA混合物中檢出限為10 fg豬源性DNA和0.001%（w/w）豬源性DNA，該方法可以在1.5 h內(nèi)完成檢測，而且與探針法相比成本低4倍。Kim等[52]用線粒體細(xì)胞色素b基因設(shè)計(jì)了驢源性特異性引物和探針，建立了熒光定量PCR檢測不同肉制品中驢源性成分的方法，檢測限為0.001 ng DNA，在生、煮、烤、烘干、研磨、油炸和高壓滅菌的肉制品中的檢測限為0.001%。Li等[53]提出了一種基于參考引物的熒光定量PCR方法，用于定量測定山羊肉中摻雜的豬源性成分，對(duì)不同比例的豬和山羊肉混合物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示該方法的準(zhǔn)確度較高、耗時(shí)短、操作簡便。

表2 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法、常規(guī)PCR與熒光定量PCR比較Table 2 Comparison of standard culture method, conventional PCR and real-time qPCR

3.2.2 乳制品中摻雜摻假的檢測 馬奶酒（酸馬奶）傳統(tǒng)上是由馬乳自發(fā)發(fā)酵而成，生產(chǎn)者和交易者存在將馬制品與牛制品摻假的可能性。Guo等[54]建立了基于物種特異性的TaqMan探針三重?zé)晒舛縋CR的方法，用于鑒定牛乳和乳制品中的牛源性物質(zhì)和馬源性物質(zhì)，同時(shí)擴(kuò)增了內(nèi)源性對(duì)照，以消除假陰性的可能，該方法檢測牛乳、酸牛乳和馬乳檢出限為0.001 ng，酸湯和馬奶酒檢出限為0.005 ng，此外，使用不同源性乳品混合物有效驗(yàn)證了該方法良好的特異性、敏感性和可重復(fù)性。Domenico等[55]開發(fā)了一種TaqMan探針的熒光定量PCR快速測定方法，可用于乳制品中的物種鑒定，該方法被證明對(duì)牛、綿羊、水牛和山羊源性物質(zhì)具有敏感性、快速性和特異性。

3.2.3 飲料中摻雜摻假的檢測 藍(lán)莓、樹莓、蔓越莓等小漿果不僅口感好、能量低而且含有豐富的有益健康的生物活性物質(zhì)，因此受到廣大消費(fèi)者的青睞。Yang等[56]建立了一種基于TaqMan探針的熒光定量PCR方法，用于鑒別小漿果產(chǎn)品中蔓越莓、覆盆子和藍(lán)莓的原料成分，并對(duì)經(jīng)過巴氏殺菌以及高溫高壓處理的小漿果產(chǎn)品進(jìn)行了測試，驗(yàn)證了其適用性。將該方法用于對(duì)小漿果產(chǎn)品摻雜摻假的檢測，可確定小漿果產(chǎn)品的真實(shí)性，避免消費(fèi)者受欺詐，同時(shí)預(yù)防食物過敏。

咖啡粉和速溶咖啡中常常會(huì)有摻入各種價(jià)格便宜谷物的情況，如烤大麥、玉米、大豆等，因此，需要對(duì)磨碎的咖啡豆和速溶咖啡進(jìn)行摻雜摻假的鑒別。Ferreira等[57]開發(fā)了一種基于熒光定量PCR的方法，用于檢測商用磨碎和速溶咖啡中的谷物，對(duì)大麥、玉米和大米源性物質(zhì)的檢出限分別為0.6、14和16 pg。通過對(duì)不同國家地區(qū)的30個(gè)咖啡商品進(jìn)行檢測，驗(yàn)證了該方法的適用性。

3.2.4 其他食品中摻雜摻假的檢測 藏紅花是印度、西班牙、法國等地區(qū)常用的一種調(diào)味料，其生產(chǎn)和收獲的成本很高。Villa等[58]提出了基于Eva Green染料的熒光定量PCR方法檢測藏紅花中摻雜的紅花，檢測限為2 pg的紅花DNA。

冬蟲夏草被描述為草藥“蟲草”中藥用成分的唯一來源，而蛹蟲草和天牛兩種真菌是食品成分的真菌來源。這三種植物的相互替代和摻雜摻假，嚴(yán)重影響了食品的安全性，降低了草藥的治療效果。Moon等[59]建立了一種熒光定量PCR檢測鑒別食品和草藥中真正的蟲草和摻假物種摻假程度的方法。

3.3 轉(zhuǎn)基因食品的檢測

轉(zhuǎn)基因食品是指可以直接食用的轉(zhuǎn)基因生物或者采用轉(zhuǎn)基因生物加工而成的食品，是最早應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測的一個(gè)食品領(lǐng)域。1999年，熒光定量PCR技術(shù)首次應(yīng)用于食品中轉(zhuǎn)基因玉米和大豆的檢測，為日后該技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用提供了參考[7]。王鳳軍等[60]采用多重?zé)晒舛縋CR對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆及其加工產(chǎn)品進(jìn)行檢測，該方法可同時(shí)檢測內(nèi)源基因和外源基因，提高了效率，降低了成本，實(shí)現(xiàn)了一管多檢，為轉(zhuǎn)基因大豆及其制品提供了便捷高效的檢測方法。權(quán)永兵等[61]采用熒光定量PCR分別對(duì)5種不同方法提取的大米Bt63轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測。王洪健等[62]建立了熒光定量PCR檢測蛋白粉中轉(zhuǎn)基因成分的方法。邵彪等[63]以啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因特異性序列為檢測目標(biāo)，對(duì)肉制品中添加的植源性轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR檢測，解決了DNA在加工過程中遭到破壞而產(chǎn)生假陰性的問題，同時(shí)使檢測更加方便快捷。

3.4 食品中過敏原的檢測

食品中的八大過敏原包括乳品、蛋類、花生、小麥、大豆、堅(jiān)果、魚類和甲殼類，近年來，采用熒光定量PCR對(duì)多種過敏原進(jìn)行了檢測（表3）。Guan等[64]用基于TaqMan探針的熒光定量PCR技術(shù)對(duì)牛奶中過敏原α-乳清蛋白進(jìn)行分析檢測，檢測限為0.05 ng，可以在3 h內(nèi)完成DNA的提取和檢測，與依賴于蛋白質(zhì)檢測的方法相比，該技術(shù)具有更大的熱穩(wěn)定性和更強(qiáng)的分析加工食品的能力，并且更便宜、快捷和靈敏。Linacero等[65]在過敏原編碼序列上設(shè)計(jì)新型引物，利用熒光定量PCR方法檢測食品中的核桃過敏原，檢測限為2.5 pg核桃DNA，與ELISA分析比較，該方法在核桃的痕量檢測中顯示出更高的靈敏度和可靠性。

表3 熒光定量PCR在過敏原檢測中的應(yīng)用Table 3 Application of real-time qPCR in the detection of allergens

3.5 食源性寄生蟲的檢測

環(huán)孢子蟲是一種原生動(dòng)物寄生蟲，食用被其卵囊污染的新鮮果蔬產(chǎn)品或水會(huì)引起人類腹瀉病。Murphy等[78]開發(fā)了一種優(yōu)化的TaqMan探針熒光定量PCR測定法，并通過該方法和巢式PCR分別對(duì)香菜和覆盆子進(jìn)行檢測，兩種方法經(jīng)過對(duì)比表明，熒光定量PCR工作量較小，操作簡單快捷，不易受擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，并且可以對(duì)擴(kuò)增和結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控分析。Temesgen等[79]開發(fā)并評(píng)估了一種新穎的多重?zé)晒舛縋CR，用于同時(shí)檢測漿果中的多房棘球絳蟲、剛地弓形蟲和環(huán)孢子蟲，該檢測方法不但可以分析漿果水果，也可以很好地用于其他類型的新鮮農(nóng)產(chǎn)品的檢測。Frey等[80]建立了一種熒光定量PCR與熔解曲線分析相結(jié)合的新型檢測技術(shù)用于分離、檢測和區(qū)分葉類蔬菜和漿果中的絳蟲蟲卵，可用于監(jiān)測含有絳蟲的產(chǎn)品污染情況，以評(píng)估消費(fèi)者的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

3.6 可食用昆蟲的檢測

食用昆蟲的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)元素等含量豐富，具有營養(yǎng)價(jià)值高的優(yōu)點(diǎn)，但不是所有昆蟲都是安全可食用的。Kim等[81]開發(fā)了基于TaqMan探針的熒光定量PCR快速檢測方法，可在40 min內(nèi)完成對(duì)食品中可食用稻蝗的檢測，絕對(duì)檢出限為0.5 pg稻蝗DNA，在經(jīng)過處理的昆蟲混合物中檢出限為0.1%，該方法是一種高度特異、靈敏且快速的方法，為鑒別可食用稻蝗和加工食品中的稻蝗源性成分提供了參考。可食用蠶常常會(huì)被加工成粉末狀，為了避免與其他昆蟲混淆，Kim等[82]使用TaqMan探針的熒光定量PCR方法檢測可食用家蠶，檢測限為0.001 ng蠶DNA，為向消費(fèi)者提供準(zhǔn)確的食品標(biāo)簽信息提供了方法。

昆蟲是目前的新興食品來源，其可能攜帶對(duì)人類的身體健康存在一定風(fēng)險(xiǎn)的抗生素耐藥基因，在食品安全方面尚需對(duì)其抗生素耐藥性進(jìn)行定量評(píng)估。Vandeweyer等[83]對(duì)熒光定量PCR進(jìn)行了優(yōu)化，用以檢測和量化食用昆蟲中的抗生素抗性基因tet（O，K，M，S）和erm（B），并利用該技術(shù)檢測不同生產(chǎn)和飼養(yǎng)批次的30個(gè)新鮮昆蟲樣品，結(jié)果表明，粉蟲比蟋蟀樣品平均含有更多的tet（K）、tet（M）和tet（S）基因，僅在蟋蟀樣品中存在tet（O）基因，一個(gè)粉蟲樣品中還檢測到erm（B）基因。Milanovi?等[84]用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)即食蝗蟲和粉蟲中的5種碳青霉烯抗 性 基 因（blaNDM-1、blaVIM、blaGES、blaOXA-48、blaKPC）進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，粉蟲樣本中沒有檢出blaGES、blaKPC和blaVIM基因，蝗蟲樣本中沒有檢測到blaGES和blaKPC基因，但blaOXA-48在樣本中普遍存在。

4 結(jié)論與展望

近年來，隨著科技的發(fā)展和檢測的需要，熒光定量PCR技術(shù)在很多領(lǐng)域的檢測方面具有很重要的作用和意義。熒光定量PCR技術(shù)屬于分子生物學(xué)檢測技術(shù)中的一種，憑借高自動(dòng)化、被污染率小、靈敏、高效、快捷等特點(diǎn)，在快速檢測食品的致病菌、摻雜摻假、轉(zhuǎn)基因、過敏原等方面已取得大量的研究進(jìn)展。然而熒光定量PCR技術(shù)還存在一些不足，比如：a.設(shè)備成本高；b.檢測所需的引物和探針價(jià)格較高；c.需要培訓(xùn)專業(yè)技術(shù)人員來操作；d.樣品中可能存在抑制PCR進(jìn)程的物質(zhì)；e.某些染料可能會(huì)與體系中非特異性DNA結(jié)合。但是熒光定量PCR技術(shù)在快速檢測領(lǐng)域仍具有很大優(yōu)勢。與酶聯(lián)免疫法相比，其在痕量檢測時(shí)具有更高的靈敏度和可靠性，而且外部環(huán)境對(duì)酶聯(lián)免疫檢測有一定影響，還有發(fā)生交叉反應(yīng)的可能；與生物傳感器相比，生物傳感器雖然操作簡單易于攜帶，但是檢測成本高，抗體的純化和修飾也比較困難；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)靈敏、專一、步驟少，可減少樣品損耗，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境條件要求很高，容易產(chǎn)生假陽性；與依賴于蛋白質(zhì)檢測的方法相比，熒光定量PCR具有更大的熱穩(wěn)定性和更強(qiáng)的分析加工食品的能力。

熒光定量PCR技術(shù)在食品快速檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速，將其與其他技術(shù)相結(jié)合是目前一大發(fā)展方向，比如：a.PMA與熒光定量PCR相結(jié)合，適量的PMA可以抑制死細(xì)胞DNA擴(kuò)增，從而避免提取到死細(xì)胞的DNA而造成的假陽性；b.免疫磁珠法與熒光定量PCR相結(jié)合，免疫磁珠可以高特異性富集目標(biāo)菌，從而提高檢測的效率和準(zhǔn)確性；c.芯片與熒光定量PCR相結(jié)合，簡化實(shí)驗(yàn)操作，使檢測時(shí)間更短[11]；d.自動(dòng)化檢測體系與熒光定量PCR相結(jié)合，減少實(shí)驗(yàn)員操作，避免檢測過程中的微生物污染[12]。未來可在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化設(shè)計(jì)引物和探針的操作、降低檢測成本，擴(kuò)大使用范圍，解決導(dǎo)致檢測結(jié)果假陽性的問題。此外，開發(fā)便于攜帶和操作的試劑盒產(chǎn)品，使檢測不僅限于實(shí)驗(yàn)室中，而可以隨時(shí)隨地進(jìn)行，提高檢測的時(shí)效性和便利性，使熒光定量PCR技術(shù)擁有更大發(fā)展空間。