張 波，王正峰，朱 駿，嚴(yán) 俊，陳浩斐，張寶騰，周文策,2

胰腺癌是一種高度致命的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率持續(xù)上升，5年生存率僅為9%，預(yù)計(jì)在未來20～30年其將成為癌癥相關(guān)死亡的第二大病因[1-2]；手術(shù)切除是唯一治愈的機(jī)會(huì)，但由于胰腺癌早期癥狀不典型且易轉(zhuǎn)移，缺乏有效的診療手段，大多數(shù)患者確診時(shí)已失去手術(shù)根治機(jī)會(huì)。因此，尋找有效的早期診斷生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)成為臨床研究的重點(diǎn)。Legumain(LGMN)是半胱氨酸蛋白酶C13家族的一員，最初發(fā)現(xiàn)于豆科植物中，也存在于人體內(nèi)，其定位于人第14號(hào)染色體上，編碼433個(gè)氨基酸[3]。研究顯示LGMN為促癌基因，能夠促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，并參與調(diào)節(jié)患者的預(yù)后[4-5]。但是關(guān)于LGMN與胰腺癌的關(guān)系鮮有報(bào)道。慢性胰腺炎是胰腺癌的主要危險(xiǎn)因素，研究發(fā)現(xiàn)[6]，LGMN通過激活TGF-β1促進(jìn)慢性胰腺炎纖維的形成，作者推測LGMN參與胰腺癌的進(jìn)展。本文通過檢測胰腺癌組織和癌旁組織中LGMN的表達(dá)，分析其臨床意義；并在細(xì)胞水平進(jìn)行驗(yàn)證，探討LGMN在胰腺癌中的作用情況，以期為胰腺癌的治療和預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織學(xué)標(biāo)本 收集2015年6月～2019年12月蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外科實(shí)施根治性手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的胰腺癌組織67例及其對應(yīng)癌旁組織61例，其中男性47例，女性20例，年齡30～79歲，平均60歲。所有病例臨床資料均完整，術(shù)前均未行放、化療等抗腫瘤治療。

1.1.2細(xì)胞及病毒 人胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1和胰腺正常上皮細(xì)胞HPNE購自上海中科院，Legumain shRNA慢病毒和陰性對照組由上海漢尹生物公司合成。

1.1.3主要試劑 DAB試劑盒和SP試劑盒購自福州邁新生物公司，胎牛血清(FBS)和RPMI-1640培養(yǎng)基購自以色列BI公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增試劑盒購自日本Takara公司，引物GAPDH和Legumain購自上海生工公司，CCK-8試劑購自日本同仁公司，Transwell小室購自美國Corning公司，BCA蛋白定量試劑盒購自江蘇碧云天公司，BCL-2抗體購自美國Abcam公司，Bax、Legumain以及GAPDH抗體購自美國CST公司，二抗購自美國SAB公司，PVDF膜和ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP法檢測LGMN的表達(dá)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。將4 μm厚切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，使用檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)在壓力鍋中進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后PBS洗3次，加入100 μL兔抗人LGMN一抗(1 ∶800)，4 ℃冰箱過夜。待一抗復(fù)溫、PBS洗滌后，加入二抗，室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封固。

結(jié)果判定：每張切片由兩名資深病理科醫(yī)師根據(jù)切片陽性細(xì)胞染色比例及染色強(qiáng)度綜合判定LGMN染色結(jié)果。(1)按染色強(qiáng)度計(jì)分：不著色為0分，淡黃色(弱陽性)為1分，棕黃色(中等陽性)為2分，棕褐色(強(qiáng)陽性)為3分；(2)按陽性細(xì)胞染色比例計(jì)分：無陽性腫瘤細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)<20%為1分，20%～50%為2分，51%～70%為3分，>70%為4分；將上述兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘作為最終結(jié)果：≥4分為高表達(dá)，≤3分為低表達(dá)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒轉(zhuǎn)染 AsPC-1細(xì)胞用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，HPNE細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的AsPC-1細(xì)胞消化后鋪在6孔板中，待細(xì)胞匯合度在30%～40%時(shí)進(jìn)行病毒感染。共分為3組：以未干預(yù)的細(xì)胞作為空白對照組，轉(zhuǎn)染空白載體細(xì)胞為陰性對照組，LGMN敲低細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染指南，按MOI=20加入慢病毒液感染24 h，3天后在陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組中加入2 μg/mL的嘌呤霉素，隔天換液，篩選10天獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。

1.2.3RNA提取和RT-PCR TRIzol試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA，將此原液稀釋5倍后采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。引物序列如下：Legumain引物序列：上游5′-CGTTGTGATGATGTACGATGAC-3′，下游5′-GACTCCCTGATAGACATCTGTG-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GTCTCCTCTGACTTCAA CAGCG-3′，下游5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′，運(yùn)用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn) 胰酶消化對數(shù)生長期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整密度為每毫升2×104個(gè)細(xì)胞，按每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板，每組重復(fù)5次。將CCK-8溶液和無血清RPMI-1640培養(yǎng)基按1 ∶10配置，棄掉原液后，每孔加100 μL配置液，培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀測450 nm波長處的吸光度(OD)值，每天測1次，連測4天。采用GraphPad 7.00軟件繪增殖曲線。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn) 三組細(xì)胞胰酶消化后用無血清的培養(yǎng)基重懸；取600 μL RPMI-1640培養(yǎng)基(含30%FBS)加入Transwell下室、200 μL細(xì)胞懸液(含3×104個(gè)細(xì)胞)接種于上室，隨后將該24孔板移至孵箱中培養(yǎng)36 h；4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，PBS洗滌后倒置顯微鏡下多視野拍照(200×)。

1.2.6Western blot法 提取各組細(xì)胞總蛋白，使用BCA法測其濃度，定量后100 ℃沸水中煮10 min使蛋白變性。配膠，上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，切膠，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗(LGMN、BCL-2、Bax及GAPDH，稀釋比均為1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。復(fù)溫，TBST洗膜10 min×3次，加入HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比1 ∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL曝光顯影。采用Image J軟件行條帶灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩個(gè)樣本計(jì)數(shù)資料間差異采用四格表χ2檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較采用單因素方差分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌及癌旁組織中LGMN的表達(dá)LGMN主要定位于細(xì)胞質(zhì)，67例胰腺癌組織中44例(65.7%)高表達(dá)，23例(34.3%)低表達(dá)；61例癌旁組織中僅3例(4.9%)高表達(dá)，其余58例(95.1%)均為低表達(dá)；胰腺癌組織中LGMN的高表達(dá)率明顯高于癌旁組織(χ2=50.720，P<0.01)。高表達(dá)LGMN的胰腺癌組織可見腫瘤上皮細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色，染色面積大；癌旁組織胰腺正常上皮細(xì)胞中LGMN為陰性或呈淡黃色，同時(shí)發(fā)現(xiàn)LGMN在部分胰腺腺泡中也有一定的表達(dá)(圖1)。

ABC

2.2 LGMN表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系LGMN蛋白表達(dá)與胰腺癌患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、TNM分期、血管侵犯、CA19-9水平無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；腫瘤分化程度越低或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，LGMN的表達(dá)量越高(表1)。

表1 胰腺癌中LGMN表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 胰腺細(xì)胞系中LGMN的表達(dá)及其在AsPC-1細(xì)胞中的敲低情況RT-PCR結(jié)果顯示，LGMN mRNA在AsPC-1細(xì)胞中的相對表達(dá)量(2.159 0±0.108 2)顯著高于HPNE細(xì)胞(1.000 0±0.020 2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.52，P=0.000 5)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)AsPC-1細(xì)胞中的LGMN蛋白相對表達(dá)量(0.952 8±0.049 0)亦高于HPNE細(xì)胞(0.503 5±0.063 7)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.152，P=0.002，圖2A)。轉(zhuǎn)染慢病毒后，實(shí)驗(yàn)組LGMN mRNA和蛋白相對表達(dá)量較對照組均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2B～D)。

圖2 胰腺細(xì)胞系中LGMN的表達(dá)及其在AsPC-1細(xì)胞中的敲低情況：A、B.LGMN蛋白表達(dá)電泳圖；C、D.LGMN mRNA和蛋白相對表達(dá)量直方圖；與陰性對照組相比，***P<0.001，****P<0.000 1

2.4 LGMN敲低對AsPC-1細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8法比較24 h、48 h及72 h三組細(xì)胞的OD值，與空白對照組相比，陰性對照組細(xì)胞的OD值減小(P24 h=0.059 9，余P<0.01)；與空白、陰性對照組相比，LGMN敲低組細(xì)胞的OD值均明顯減小(P<0.001，圖3)；表明下調(diào)LGMN可抑制AsPC-1細(xì)胞的增殖能力。

圖3 LGMN敲低對AsPC-1細(xì)胞增殖能力的影響：與陰性對照組相比，**P<0.01，****P<0.000 1

2.5 LGMN敲低對AsPC-1細(xì)胞遷移能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)檢測AsPC-1細(xì)胞遷移能力變化，與空白對照組相比，陰性對照組穿過的細(xì)胞數(shù)目略有減少(P=0.011 8)；與空白、陰性對照組相比，LGMN敲低組穿過的細(xì)胞數(shù)目明顯減小(P<0.000 1，圖4)；表明下調(diào)LGMN可抑制AsPC-1細(xì)胞的遷移能力。

圖4 LGMN敲低對AsPC-1細(xì)胞遷移能力的影響：與陰性對照組相比，*P<0.05，****P<0.000 1

2.6 LGMN敲低對凋亡相關(guān)蛋白的影響與空白、陰性對照組相比，LGMN敲低組BCL-2蛋白表達(dá)降低，BCL-2/Bax比值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；LGMN敲低組中Bax蛋白表達(dá)雖有升高，與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖5)；表明下調(diào)LGMN可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖5 LGMN敲低對凋亡相關(guān)蛋白的影響：與陰性對照組相比，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

2003年，研究人員首次報(bào)道LGMN在多種實(shí)體腫瘤中高表達(dá)，其結(jié)構(gòu)相當(dāng)保守，多由腫瘤細(xì)胞或腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)并分泌，過表達(dá)LGMN可增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲活性[7]。在腫瘤中，LGMN可能作為一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，在缺氧或熱休克等極端條件下產(chǎn)生，參與腫瘤的進(jìn)展。LGMN是一種pH依賴性蛋白酶，在酸性溶酶體中活性最高，其活性升高可促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并與患者預(yù)后不良呈正相關(guān)[3]，揭示了LGMN作為腫瘤治療靶標(biāo)的潛力。LGMN在卵巢癌[8]、前列腺癌[9]、乳腺癌[10]、子宮頸癌[11]、胃癌[5,12]等癌組織或細(xì)胞中高表達(dá)；而且在卵巢癌[8]、乳腺癌[10]、胃癌[5]中，LGMN表達(dá)可作為獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素，其高表達(dá)患者預(yù)后更差。在治療方面，埃索美拉唑可通過抑制LGMN酶的活性來預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移[13]；口服LGMN激活修飾的聚合物納米載體，負(fù)載索拉非尼，可增強(qiáng)口服給藥到腫瘤的能力，已被用于胃癌的光熱聯(lián)合化療[14]。通過GEPIA網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，LGMN mRNA在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于胰腺正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)[15]。提示LGMN可能作為促癌因素參與胰腺癌的進(jìn)展。然而，LGMN在胰腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)和作用尚未見報(bào)道。

本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LGMN在67例胰腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織；腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胰腺癌患者預(yù)后的重要因素，LGMN表達(dá)越高，腫瘤分化程度越低或更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示LGMN與胰腺癌預(yù)后密切相關(guān)。Guo等[16]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LGMN在282例胃癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)與TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，LGMN表達(dá)越高，患者總生存期越短。這與本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。在細(xì)胞水平，胰腺癌AsPC-1細(xì)胞中LGMN表達(dá)顯著高于胰腺正常上皮細(xì)胞。下調(diào)LGMN后，細(xì)胞增殖和遷移能力均明顯減弱，說明LGMN在胰腺癌中是一種腫瘤促進(jìn)因子。Zhu等[9]研究發(fā)現(xiàn)LGMN在前列腺癌細(xì)胞中差異表達(dá)，敲低LGMN后，凋亡細(xì)胞比例明顯增加，通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，過表達(dá)則相反。Meng等[11]研究發(fā)現(xiàn)子宮頸癌細(xì)胞中LGMN高表達(dá)，下調(diào)LGMN可以抑制子宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，其機(jī)制可能是通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-3)的激活。在胃癌中也發(fā)現(xiàn)類似的情況[12]。本組實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)AsPC-1細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)LGMN敲低組死亡細(xì)胞較多，為探究其原因，遂檢測了凋亡相關(guān)蛋白的變化。Western blot法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白、陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組抑凋亡蛋白BCL-2表達(dá)顯著下降，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)上升不明顯，但BCL-2/Bax比值顯著下降。Sun等[17]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)LGMN可顯著增加氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡及Caspase-3、Caspase-9和Bax的表達(dá)。何開明等[18]在肺癌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)Cyr61過表達(dá)可通過促進(jìn)凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)、抑制BCL-2表達(dá)來激活Caspase-3通路，從而抑制細(xì)胞的增殖。陳筱雪等[19]在破骨前體細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了類似研究。表明下調(diào)LGMN可能通過BCL-2/Bax激活凋亡通路從而誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，造成實(shí)驗(yàn)組和對照組死亡細(xì)胞差異。

綜上所述，LGMN在胰腺癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)LGMN可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞AsPC-1的增殖和遷移能力，并通過調(diào)控BCL-2/Bax的表達(dá)，激活凋亡通路，促進(jìn)AsPC-1細(xì)胞凋亡。LGMN對胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展起重要促進(jìn)作用，在分化程度更低或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者中預(yù)測更好，其可能成為胰腺癌治療和預(yù)后的新靶點(diǎn)，但其具體的作用機(jī)制仍待深入探究。