王 文，范方程，鄧瑞德，楊文江，董 偉

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

隨著豬場生物安全防控措施逐漸完善與有效疫苗規(guī)范接種，豬場發(fā)生病毒性傳染病的情況逐漸減少。但由于抗生素的不合理使用與養(yǎng)殖戶對細菌性疾病防控的忽視，部分細菌性病原在我國豬場仍然十分常見。豬鏈球菌在臨床上十分常見，該病原感染豬可導(dǎo)致患豬出現(xiàn)腦膜炎、關(guān)節(jié)腫大或敗血癥等[1]。此外，該病原也是常見的人畜共患性病原，部分血清型病原可通過傷口或黏膜等途徑感染人，并引發(fā)嚴(yán)重的臨床癥狀，如腦膜炎和敗血癥等[2]。近年來雖然人們對人畜共患性疾病的防控意識有較大提高，但豬鏈球菌感染人的案例仍有發(fā)生[3-4]。

目前對豬鏈球菌的初步鑒定主要是分析菌株在培養(yǎng)基的生長特性、革蘭氏染色特性和生化特性等，但這些傳統(tǒng)的手段無法對致病菌進行準(zhǔn)確的種類鑒定，因此可采用PCR法對菌株16S rDNA基因序列進行擴增與分析，確定細菌種類。此外，根據(jù)莢膜多糖抗原差異可將豬鏈球菌分為35個血清型，其中可感染人的血清型有4種，分別為1、2、7和9型，也可以通過PCR法擴增不同血清型鏈球菌特異性序列，進而確定菌株的血清型[5-6]。

2019年8月，湖南湘潭某豬場部分保育豬突然發(fā)病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫大、敗血癥和神經(jīng)癥狀（如劃水狀和轉(zhuǎn)圈等），初步剖檢可發(fā)現(xiàn)病畜淋巴結(jié)腫大、關(guān)節(jié)腔有積液、脾臟腫大和腦膜充血、出血等。為了確診致病原，該場負責(zé)人采集死亡病豬病變組織（肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等）送至湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽疾病檢測實驗室，工作人員對組織病理進行細菌分離鑒定及藥敏試驗，旨在為該場疫情的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2頭病死保育豬病料來源于湖南省湘潭某豬場，其中病料包括淋巴結(jié)、肺臟、腎臟和腦組織等。

1.2 主要試劑

PCR預(yù)混液、DL 2 000 DNA Marker等試劑購自于TaKaRa公司，胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基購自于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自于杭州微生物試劑有限公司。

1.3 細菌分離與革蘭氏染色鑒定

嚴(yán)格按照無菌操作，用高溫灼燒后的接種環(huán)蘸取少量病變組織液接種TSA培養(yǎng)基表面，在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h后挑取單一菌落進一步純化，挑取純化的菌落于TSB培養(yǎng)基擴增，并將擴增菌液適當(dāng)稀釋后進行革蘭氏染色鑒定。

1.4 細菌16S rDNA基因序列擴增

以DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA，根據(jù)參考文獻合成細菌鑒定通用引物[5]。引物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司合成，其擴增片段大小約1 200 bp，PCR反應(yīng)體系（25 μL）包括PCR mix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板1.0 μL及雙蒸水10.5 μL，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)，72 ℃再延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5.0 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.5 豬鏈球菌血清型鑒定

根據(jù)鏈球菌不同血清型基因組特異性，以及參考文獻[7]合成鏈球菌1、2、7、9型對應(yīng)PCR引物，預(yù)期擴增片段大小分別為444 bp、363 bp、590 bp和442 bp。PCR反應(yīng)體系（25 μL）包括PCR mix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板1.0 μL及雙蒸水10.5 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72 ℃再延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5.0 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.6 小鼠致病性試驗

將12只5周齡雌性昆明小鼠隨機分為2組，每組6只，其中試驗組腹腔注射分離菌株100 μL（1×108CFU/mL），對照組腹腔注射等量生理鹽水。每日觀察各組小鼠臨床及死亡情況，并對死亡小鼠進行剖檢，觀察組織病變情況。

1.7 藥敏試驗

采用藥敏紙片擴散法對分離致病菌進行藥敏試驗，將細菌稀釋至1×107CFU/mL，取200 μL稀釋菌液涂布于TSA培養(yǎng)基表面，待菌液稍干，取不同藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，將培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測定不同藥敏紙片抑菌圈，根據(jù)相關(guān)判定標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果

2.1 細菌形態(tài)及革蘭氏染色鑒定結(jié)果

將病料組織液接種于TSA培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基表面長有圓形、透明、水滴狀菌落，進一步進行革蘭氏染色，結(jié)果如圖1所示，菌株屬于革蘭氏陽性菌，其形態(tài)特征主要為數(shù)個球狀細菌排列為鏈狀，可將其初步判定為豬鏈球菌。

圖1 豬鏈球菌分離株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

2.2 PCR擴增及序列分析結(jié)果

將分離菌株擴增后提取基因組DNA，用細菌通用引物對其16S rDNA基因序列進行擴增，凝膠電泳結(jié)果如圖2（左）所示，該菌株16S rDNA基因序列PCR產(chǎn)物大小約1 700 bp，進一步測序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株序列與已知豬鏈球菌分離株（登錄號：AF009476）同源性高于99%，提示本試驗獲得分離株為豬鏈球菌。用不同血清型鑒定引物對本試驗獲得豬鏈球菌進行分子鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅擴增出約330 bp條帶（圖2右），與豬鏈球菌2型PCR擴增目的條帶基本相符，而其它血清型引物未擴增出條帶，提示本試驗獲得菌株為豬鏈球菌2型。

圖2 豬鏈球菌16S rDNA基因與血清型鑒別引物PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

2.3 小鼠致病性試驗

為進一步分析該分離株的致病性，以昆明小鼠為動物模型，對試驗組小鼠腹腔注射菌液100 μL，對照組則注射生理鹽水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗組小鼠接種細菌后均出現(xiàn)呼吸急促、精神萎靡和運動頻率下降等癥狀，且試驗組小鼠在24 h內(nèi)均出現(xiàn)死亡，但對照組小鼠則健康。剖檢結(jié)果表明死亡小鼠不同臟器均有出血癥狀，且從小鼠病變組織中也分離出該致病菌。

2.4 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果如表1所示。本試驗分離的豬鏈球菌2型分離株對氨芐西林、阿莫西林、頭孢拉定、頭孢唑林、頭孢氨芐、頭孢噻肟、青霉素、環(huán)丙沙星和克林霉素高度敏感，對紅霉素和恩諾沙星中度敏感，但對鏈霉素、林可霉素和氟苯尼考耐藥。

表1 豬鏈球菌對不同抗生素藥敏試驗判定結(jié)果

3 討論

豬鏈球菌在我國養(yǎng)豬場較為常見，該病原也可以感染人，是一種對人畜危害很大的傳染性病原。豬鏈球菌可分為多種血清型，但豬鏈球菌2型為主要流行的血清型，且該血清型病原致病力較高，甚至可導(dǎo)致患畜死亡[3，6]。本試驗從湘潭縣某豬場發(fā)病保育豬組織病料中分離出一例病原菌，形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法鑒定結(jié)果顯示該菌為豬鏈球菌2型，且對小鼠具有較強的致病力。

由于豬場抗生素不合理的使用導(dǎo)致部分鏈球菌出現(xiàn)耐藥情況嚴(yán)重，但不同地區(qū)或豬場流行的豬鏈球菌耐藥情況差異較大。鄧智丹等[8]研究表明，廣東省某規(guī)模化豬場流行的2型豬鏈球菌對青霉素、阿莫西林、頭孢類（頭孢拉定、頭孢噻呋等）和恩諾沙星等藥物敏感，但對強力霉素耐藥；楊春蕾等[9]調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)2型鏈球菌天津分離株對阿米卡星、四環(huán)素和強力霉素等高度耐藥。而本試驗分離的菌株對鏈霉素、林可霉素和氟苯尼考高度耐藥，但對頭孢類、青霉素和環(huán)丙沙星等藥物高度敏感，這與鄧智丹等[8]和楊春蕾等[9]的研究結(jié)果有差異，同時也說明了對分離菌株進行藥敏試驗分析的重要性。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果可篩選對該致病菌敏感的藥物，從而有利于快速制定防控該病的有效措施。