吳華莉，曹建國(guó)，張鶯鶯，涂尾龍，王洪洋，黃 濟(jì)，談?dòng)浪?/p>

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 閔行 201106；2.上海市種豬工程技術(shù)研究中心，上海浦東新區(qū) 201302）

MMPs（Matrix metalloproteinases,基質(zhì)金屬蛋白酶）是一類具有鋅依賴性內(nèi)肽酶同源結(jié)構(gòu)域的蛋白水解酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)各種成分的降解和重建平衡，通過(guò)裂解作用釋放生長(zhǎng)因子、細(xì)胞膜結(jié)合蛋白和細(xì)胞因子而發(fā)揮生物學(xué)作用。MMPs家族基因參與胚胎發(fā)育、繁殖和組織修復(fù)等生理過(guò)程[1]。MMP19（Matrix metallopeptidase 19）是MMPs家族成員之一，參與生長(zhǎng)發(fā)育和疾病的細(xì)胞外基質(zhì)各種成分的降解過(guò)程[2-3]。人MMP19定位于12號(hào)染色體，mRNA在人體各種組織中廣泛表達(dá)[4]。豬MMP19基因定位于5號(hào)染色體。豬MMP19全基因組長(zhǎng)度6 340 bp，包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，mRNA在豬肝臟表達(dá)量最高，在脾臟和卵巢組織等也有高表達(dá)量[5]。有研究發(fā)現(xiàn)豬MMP19基因第5外顯子第203 bp處多態(tài)位點(diǎn)產(chǎn)生的不同基因型個(gè)體在生長(zhǎng)指標(biāo)、免疫指標(biāo)以及眼肌高度差異顯著[6-7]。杜洛克、長(zhǎng)白、大白和梅山豬具有良好的繁殖性能和優(yōu)良的肉用性能。申農(nóng)豬是上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所用長(zhǎng)白×（大白×二花臉）經(jīng)橫交固定、世代選育形成的母本新品系。目前關(guān)于豬MMP19基因多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)報(bào)道較少。本試驗(yàn)檢測(cè)MMP19基因第5外顯子在上海地區(qū)5個(gè)豬群體中的多態(tài)性，期望為豬繁殖、生長(zhǎng)指標(biāo)和疾病的分子育種候選基因提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

試驗(yàn)于2019年7—10月在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所進(jìn)行。采集樣品品種包括杜洛克（92頭）、長(zhǎng)白豬（76頭）、大白豬（153頭）、申農(nóng)豬（72頭）、梅山豬（108頭），總計(jì)501頭；采用樣品來(lái)源于上海祥欣畜禽有限公司、上海警備區(qū)富民農(nóng)場(chǎng)和上海豬狀元畜牧綜合場(chǎng)；采集部位為耳組織塊。PCR所用試劑Taq酶和MseⅠ酶購(gòu)于寶生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 采用AXYGEN基因組試劑盒提取組織DNA，測(cè)定DNA濃度，稀釋DNA，使每管濃度達(dá)到50 ng/mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物及PCR擴(kuò)增 上游引物：5'-ACTCTG ACCGCCTTCCTC-3'；下游引物：5'-TCAAGCCC GAAGAGGTGC-3'[5]。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物由1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，要求目的條帶單一明亮無(wú)雜帶，符合條件的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切試驗(yàn)，采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。

1.2.3 基因型分析 豬MMP19基因PCR擴(kuò)增片段為354 bp，存在MseⅠ酶切位點(diǎn)，基因型判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 MMP19基因酶切后基因型判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-RFLP檢測(cè)

用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，目的條帶大小與預(yù)期一致。圖1顯示，TT型為1條帶，CC型為2條帶，TC型雜合子為3條帶。根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)每個(gè)個(gè)體的基因型。

圖1 MMP19基因酶切檢測(cè)

2.2 MMP19基因在5個(gè)豬群體內(nèi)的基因型頻率和等位基因頻率

采用PCR-RFLP技術(shù)，MMP19基因在5個(gè)豬群體內(nèi)的多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果見表2。由表2可見，MMP19基因第5外顯子多態(tài)性在5個(gè)豬群體內(nèi)的基因型頻率和等位基因頻率表現(xiàn)為：在杜洛克和長(zhǎng)白豬群體內(nèi)檢測(cè)出CC型為主要基因型，雜合子TC基因型略少，只有少量TT基因型，C等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因；在大白豬和申農(nóng)豬群體內(nèi)占優(yōu)勢(shì)的是CC基因型和C等位基因；在梅山豬群體內(nèi)TC型為主要基因型，CC基因型略少，只有少量TT基因型。本研究結(jié)果顯示，MMP19基因在杜洛克、長(zhǎng)白和梅山豬群體內(nèi)檢測(cè)出3種基因型，在大白和申農(nóng)豬群體內(nèi)檢測(cè)出2種基因型。

表2 MMP19基因在5個(gè)豬群體內(nèi)的基因型頻率和等位基因頻率

3 討論

趙永貞研究結(jié)果表明，CC型個(gè)體平均日增重、滴水損失和眼肌高度顯著高于TC型[5]。本研究檢測(cè)MMP19基因在杜洛克、長(zhǎng)白、大白和申農(nóng)豬群體內(nèi)CC型為優(yōu)勢(shì)基因型，其中在大白豬群體內(nèi)CC型頻率為0.97。這一結(jié)果暗示杜洛克、長(zhǎng)白、大白和申農(nóng)豬群體的生長(zhǎng)性能良好。在5個(gè)豬群體內(nèi)C等位基因占優(yōu)勢(shì)，這與唐中林檢測(cè)C等位基因在長(zhǎng)白和大白群體中占優(yōu)勢(shì)的結(jié)果是一致的[6]。豬MMP19基因第5外顯子的TC型個(gè)體白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白濃度和IgG2濃度高于CC型，是因?yàn)樵搮^(qū)域存在與豬早期平均增長(zhǎng)率相關(guān)數(shù)量性狀基因座（QTL）以及與抗K88大腸桿菌的IgG2水平相關(guān)QTL[6]。有研究證實(shí)，鼠MMP19 mRNA在濾泡生長(zhǎng)、排卵和黃體溶解過(guò)程發(fā)揮重要作用[7]。豬MMP19基因第5外顯子T/C突變位點(diǎn)已被證實(shí)與平均日增重、肉質(zhì)性狀的滴水損失、嫩度和眼肌高度顯著相關(guān)，并且與脂肪性狀內(nèi)脂率相關(guān)，與免疫指標(biāo)白細(xì)胞數(shù)（WBC）和IgG2含量顯著相關(guān)[8]。豬MMP19 mRNA在豬胚胎背最長(zhǎng)肌表達(dá)量隨發(fā)育時(shí)間增加而逐漸增加[6]。這些研究都表明，MMP19基因第5外顯子的多態(tài)性與豬的生長(zhǎng)指標(biāo)、肉質(zhì)性狀和抗病性能有關(guān)，可作為豬育種的分子遺傳標(biāo)記加以深入探究。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，TC型頻率在大白豬群體很低，在梅山豬群體達(dá)0.84，在杜洛克、長(zhǎng)白和申農(nóng)豬群體內(nèi)TC型頻率約為0.4，而TT型個(gè)體在杜洛克、長(zhǎng)白和梅山豬群體檢測(cè)頻率很低，在大白和申農(nóng)豬群體均未檢測(cè)出TT型。趙永貞證實(shí)TC型個(gè)體白細(xì)胞數(shù)（WBC）和IgG2濃度顯著高于TT型（P<0.05），TC型的WBC、血紅蛋白濃度（HGB）和IgG2高于CC型，但未達(dá)到差異顯著水平[5]。這說(shuō)明除大白豬群體外，梅山豬、杜洛克、長(zhǎng)白和申農(nóng)豬群體內(nèi)與免疫指標(biāo)相關(guān)的TC型頻率較高，進(jìn)一步研究可測(cè)定這些豬群體的生長(zhǎng)指標(biāo)、繁殖性能指標(biāo)以及免疫指標(biāo)并進(jìn)行相關(guān)分析，以期為分子育種提供參考數(shù)據(jù)。