程琳 謝紫云 里健 薄濤

（1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院兒科，湖南長沙 410011；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心，湖南長沙 410013）

應(yīng)用合成類糖皮質(zhì)激素（synthetic glucocorticoids，sGCs）促進胎兒肺成熟，降低早產(chǎn)兒發(fā)生新生兒呼吸窘迫綜合征風(fēng)險和嚴(yán)重程度，已有近40年歷史［1-2］。近年來，應(yīng)用sGCs治療早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良也逐漸被廣泛接受［3-4］，這有效地提高了早產(chǎn)兒的生存率，并逐漸成為治療新生兒呼吸系統(tǒng)疾病的重要手段之一。但圍生期應(yīng)用sGCs對發(fā)育中的腦長期潛在的不良影響被持續(xù)關(guān)注［5］。研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期接受糖皮質(zhì)激素治療的兒童，其發(fā)生遠期神經(jīng)系統(tǒng)不良影響的概率明顯增高。本研究團隊前期所做的一項Meta分析同樣表明早產(chǎn)兒生后應(yīng)用地塞米松治療后，在學(xué)齡前期智商值顯著降低［6］。相關(guān)動物實驗研究表明，胎兒期應(yīng)用地塞米松（dexamethasone，DEX）干預(yù)能引起雄性子代成年期認(rèn)知損害［7］，也可能跟成年期焦慮行為相關(guān)［8］。因此，深入了解sGCs對發(fā)育中腦的影響機制對臨床合理應(yīng)用sGCs有重要意義。

腦發(fā)育是由神經(jīng)元細胞增殖、遷移和分化組成的高度程序化過程，而神經(jīng)元遷移是以Lissencephaly 1（LIS1）蛋白為核心的一個信號通路調(diào)控過程［9］。LIS1與多種微管運動蛋白形成復(fù)合物，將細胞骨架蛋白與放射性膠質(zhì)細胞的細胞外基質(zhì)相連接，控制神經(jīng)元精確轉(zhuǎn)位移行［10］。因為神經(jīng)元細胞存在細長的突起，故相比于其他細胞更加依賴于一個微管運動系統(tǒng)去執(zhí)行正常細胞功能。神經(jīng)元胞漿Dynein和Dynactin作為LIS1蛋白信號通路中的關(guān)鍵微管運動蛋白，直接參與到神經(jīng)元遷移、逆向軸突運輸、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號傳導(dǎo)等過程［11-13］。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇干擾體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元LIS1表達［14］。如果Dynein和Dynactin蛋白存在缺陷或突變，可能會導(dǎo)致神經(jīng)元細胞功能異常。sGCs是否也直接作用于Dynein和Dynactin蛋白，影響神經(jīng)元遷移，從而干擾正常的腦發(fā)育和腦功能。本研究通過應(yīng)用DEX干預(yù)體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元，研究胞漿Dynein重 鏈 （Dynein heavy chain，DHC） 和Dynactin的表達變化，進一步闡明sGCs對發(fā)育中腦損害的機制。

1 材料與方法

1.1 原代胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的制備及實驗分組

取妊娠16～17 d的Sprague-Dawley大鼠（購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），無菌條件下分離胎鼠大腦皮質(zhì)，解剖顯微鏡下去除腦膜。胰蛋白酶消化后的組織置于含10%胎牛血清（杭州天杭生物科技股份有限公司）的DMEM培養(yǎng)液中，制備細胞懸液，以5×105/mL細胞懸液接種至鋪有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。體外培養(yǎng)24～48 h后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液全量換液，5 d時使用含1×10-5mol/L阿糖胞苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液全量換液，每3～4 d半量換液1次，體外培養(yǎng)7～9 d加入DEX。依據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果和DEX終濃度分為對照組（未施加DEX）、0.1μmol/L組與1.0μmol/L組，分別于DEX干預(yù)后1 d、3 d和7 d收集細胞。

1.2 實時熒光定量PCR檢測DHC和Dynactin mRNA表達

收集各組細胞，用RNA提取試劑盒（Thermo Scientific，美國）提取總RNA，使用Nanodrop 2000超微量分光光度計（Thermo，美國）測定總RNA濃度和純度，OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間。按照EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）說明書進行反轉(zhuǎn)錄，cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實時熒光定量PCR操作按照TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TakaRa，日本）說明書進行，反應(yīng)體系的組成為TB Green Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）10μL、PCR上下游引物各0.8μL、ROX參比染料0.4μL、cDNA模板2μL和滅菌用水6μL，引物序列見表1。應(yīng)用ABI 7500型實時熒光定量PCR儀（PE Applied Bio，美國）進行PCR擴增，循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性3 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。每次反應(yīng)時標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本及陰性對照均做雙管同時進行，作溶解曲線以檢測非特異擴增。內(nèi)參基因和目的基因的mRNA在每次PCR擴增后均做標(biāo)準(zhǔn)曲線，mRNA相對表達量以2-△△Ct表示，△Ct（n）=Ct目的基因（n）-Ct內(nèi)參基因（n），△△CT（n）=△Ct（n）-△Ct（1），n為循環(huán)數(shù)。每組收集4份RNA標(biāo)本，每份RNA標(biāo)本設(shè)3個平行管，檢測后取平均值。整個實驗獨立重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.3 Western blot法檢測DHC和Dynactin蛋白表達

移除培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS沖洗3次。加入200μL細胞裂解液［10 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸 （pH 7.9）、1.5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L KCl、0.5 mmol/L二硫蘇糖醇、0.2 mmol/L苯甲基磺酰氟、0.06%細胞組織裂解液-40］，冰上裂解20 min后，收集于離心管中。使用超聲細胞破碎儀粉碎打勻細胞，冰上靜置5 min后，4℃13 300 r/min離心10 min，取上清液。應(yīng)用微量板全波段酶標(biāo)儀采用紫外吸收法測定蛋白濃度。蛋白標(biāo)本加入1/4體積的5×加樣緩沖液［0.25 mol/L三羥甲基氨基甲烷（pH 6.8）、10%十二烷基磺酸鈉、0.005%溴酚藍、50%甘油、5%β-巰基乙醇］，采用10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯凝膠電泳分離，每條泳道按20μg/20μL上樣，其中旁邊兩孔加入蛋白Marker標(biāo)記。電泳結(jié)束后用半干法轉(zhuǎn)蛋白至聚偏二氟乙烯膜，于5%脫脂奶中封閉1 h。分別加一抗溶液［兔抗大鼠DHC單克隆抗體（Abcam，英國）1∶1 000，兔抗大鼠Dynactin單克隆抗體（Abcam，英國）1∶2 000，內(nèi)參照為兔抗大鼠β-actin多克隆抗體（Protein Tech，美國）1∶5 000］4℃孵育過夜，用20%吐溫-20配置的等滲緩沖鹽溶液洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗［山羊抗兔多克隆抗體（Protein Tech，美國）1∶1 000］室溫孵育2 h，用20%吐溫-20配置的等滲緩沖鹽溶液充分洗膜后，將膜置于保鮮膜上，濾紙去除殘液，加入適量的化學(xué)發(fā)光檢測試劑，覆蓋保鮮膜，采用數(shù)字凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描，使用Image J系統(tǒng)分析條帶灰度值，將目的蛋白與β-actin蛋白灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。每組收集5份標(biāo)本，每份標(biāo)本設(shè)3個平行管，檢測后取平均值。整個實驗獨立重復(fù)4次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEX對體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元DHC mRNA及其蛋白的表達影響

對照組、0.1μmol/L組、1.0μmol/L組在DEX干預(yù)后1 d、3 d和7 d，體外培養(yǎng)神經(jīng)元DHC mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。DEX干預(yù)后1 d、3 d和7 d，對照組、0.1μmol/L組和1.0μm ol/L組間體外培養(yǎng)神經(jīng)元DHC mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 DEX干預(yù)后體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元DHC mRNA表達水平比較 （±s，n=3）

表2 DEX干預(yù)后體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元DHC mRNA表達水平比較 （±s，n=3）

組別1 d3 d7 dF值P值對照組3.86±0.173.02±0.143.67±0.230.0010.999 0.1μmol/L組4.03±0.304.11±0.073.84±0.280.9520.621 1.0μmol/L組4.27±0.613.51±0.833.97±0.310.0150.985 F值0.9332.8571.377 P值0.4680.1140.318

Western blot法結(jié)果顯示，對照組、0.1μmol/L組在DEX干預(yù)后1 d、3 d和7 d，體外培養(yǎng)神經(jīng)元DHC蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；1.0μmol/L組在DEX干預(yù)后7 d神經(jīng)元DHC的蛋白表達明顯高于1 d、3 d（P＜0.05）。DEX干預(yù)后1 d和3 d，對照組、0.1μmol/L組和1.0μmol/L組間體外培養(yǎng)神經(jīng)元DHC蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。DEX干預(yù)后7 d，對照組和0.1μmol/L組間神經(jīng)元DHC蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；1.0μmol/L組神經(jīng)元DHC蛋白表達明顯高 于 對 照 組 和0.1μmol/L組 （P＜0.05）。 見 表3，圖1。

表3 DEX干預(yù)后體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元DHC蛋白表達比較 （±s，n=4）

表3 DEX干預(yù)后體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元DHC蛋白表達比較 （±s，n=4）

注：a示與同時間點對照組比較，P＜0.05；b示與同時間點0.1μmol/L組比較，P＜0.05；c示與同濃度干預(yù)1 d和3 d比較，P＜0.05。

組別1 d3 d7 dF值P值對照組0.66±0.090.73±0.070.65±0.111.1350.353 0.1μmol/L組0.69±0.040.72±0.100.75±0.080.7500.493 1.0μmol/L組0.64±0.140.75±0.080.91±0.14a,b,c5.2980.023 F值0.8262.8663.949 P值0.6790.1310.047

圖1 Western blot法檢測DEX對胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元DHC蛋白相對表達電泳圖1：對照組；2：0.1μmol/L組；3：1.0μmol/L組。

2.2 DEX對體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Dynactin mRNA及其蛋白的表達影響

對照組、0.1μmol/L組、1.0μmol/L組在DEX干預(yù)后1 d、3 d和7 d，體外培養(yǎng)神經(jīng)元Dynactin mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。DEX干預(yù)后1 d、3 d和7 d，對照組、0.1μmol/L組和1.0μmol/L組間體外培養(yǎng)神經(jīng)元Dynactin mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 DEX干預(yù)后胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Dynactin mRNA表達比較 （xˉ ±s，n=3）

Western blot法結(jié)果顯示，DEX干預(yù)后，對照組、0.1μmol/L組在3 d和7 d時體外培養(yǎng)神經(jīng)元Dynactin蛋白表達均高于1 d時（P＜0.05）；對照組7 d時神經(jīng)元Dynactin蛋白表達高于3 d時（P＜0.05）；0.1μmol/L組7 d時神經(jīng)元Dynactin蛋白表達低于3 d時（P＜0.05）。1.0μmol/L組在DEX干預(yù)后1 d、3 d和7 d神經(jīng)元Dynactin蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。DEX干預(yù)1 d時，體外培養(yǎng)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Dynactin蛋白表達在3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。在3 d和7 d時，0.1μmol/L組及1.0μmol/L組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Dynactin蛋白表達均明顯低于對照組（P＜0.05）；且7 d時，1.0μmol/L組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)Dynactin蛋白表達低于0.1μmol/L組（P＜0.05）。見表5，圖2。

表5 DEX干預(yù)后體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Dynactin蛋白表達比較 （±s，n=4）

表5 DEX干預(yù)后體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Dynactin蛋白表達比較 （±s，n=4）

注：a示與同時間點對照組比較，P＜0.05；b示與同時間點0.1μmol/L組比較，P＜0.05；c示與同濃度干預(yù)1 d比較，P＜0.05；d示與同濃度干預(yù)3 d比較，P＜0.05。

組別1 d3 d7 dF值P值對照組0.64±0.141.08±0.09c1.17±0.03c,d42.185＜0.001 0.1μmol/L組0.62±0.100.95±0.05a,c0.86±0.09a,c,d21.189＜0.001 1.0μmol/L組0.72±0.130.80±0.10a0.74±0.04a,b0.9120.428 F值0.7444.5156.011 P值0.8020.0310.018

圖2 Western blot法檢測DEX對胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Dynactin蛋白相對表達電泳圖1：對照組；2：0.1μmol/L組；3：1.0μmol/L組。

3 討論

由于存在細長的突起，神經(jīng)元要執(zhí)行正常功能，較其他細胞更依賴于一個正常運作的微管轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，而微管運動蛋白及其輔助蛋白的異常與人類神經(jīng)疾病密切相關(guān)［15-18］。胞漿動力蛋白Dynein復(fù)合體屬于細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的一大類微管運動蛋白，Dynein是一種1.4 MDa復(fù)合體，具有向微管末端運輸物質(zhì)的功能。每個Dynein復(fù)合體包括兩個亞單位，每個亞單位包括1個DHC、1個中間鏈、1個輕中間鏈和3個不同的輕鏈組成［19-21］，其中DHC含有運動域，在神經(jīng)元細胞遷移過程中，胞漿DHC與LIS1結(jié)合，形成Dynein-LIS1-核分布蛋白E類同源物1（nuclear distribution E homolog-like 1，Ndel1） 復(fù)合物［22-23］；Dynactin蛋白是Dynein蛋白的一個重要輔助運動蛋白［24-25］，促進Dynein-LIS1-Ndel1在細胞骨架中移動，兩種蛋白調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞的轉(zhuǎn)位遷移過程［26-29］。

本研究顯示在1.0μmol/L DEX干預(yù)7 d時，體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元DHC蛋白表達增高，而在3 d及7 d時，0.1μmol/L組及1.0μmol/L組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)Dynactin蛋白表達均明顯低于對照組。有研究報道DHC和Dynactin基因突變與大腦皮質(zhì)發(fā)育異常、小頭畸形等先天性神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)［15-18，30-31］，提示DHC和Dynactin表達異常將可能影響Dynein-LIS1-Ndel1復(fù)合物形成及Dynein-LIS1-Ndel1復(fù)合物在細胞骨架上的遷移過程，而這個過程與神經(jīng)元細胞的移位和遷移密切相關(guān)，因此推測DEX可能干擾胞漿動力蛋白Dynein和Dynactin的表達，從而影響到發(fā)育期神經(jīng)元的功能。

一般認(rèn)為sGCs通過與靶細胞的相關(guān)受體相結(jié)合后，轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，結(jié)合到激素反應(yīng)單元，調(diào)節(jié)靶基因表達。sGCs對相關(guān)基因表達影響出現(xiàn)的時間報道各不相同。多篇文獻報道新生鼠接受DEX后30 min海馬區(qū)c-fos基因表達即發(fā)生改變［32-33］；而羅森林等［14］報道應(yīng)用皮質(zhì)酮后，體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元LIS1表達僅在干預(yù)后7 d時發(fā)生顯著改變。本研究表明在應(yīng)用DEX后1 d時，DHC及Dynactin蛋白表達變化不顯著，在DEX干預(yù)3 d時，Dynactin蛋白表達開始出現(xiàn)下調(diào)，而干預(yù)7 d時，兩種蛋白表達均表現(xiàn)出顯著性差異，提示DEX對神經(jīng)元遷移相關(guān)蛋白表達的影響非即刻發(fā)生，而且僅在高濃度DEX干預(yù)時，更易表現(xiàn)出對DHC和Dynactin蛋白表達水平的顯著性影響。本研究探討DEX對DHC和Dynactin蛋白表達的影響時，結(jié)果提示在DEX干預(yù)7 d后1.0μmol/L組神經(jīng)元DHC蛋白表達明顯高于1 d、3 d時；對照組、0.1μmol/L組、1.0μmol/L組在DEX干預(yù)3 d、7 d時Dynactin蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但本實驗結(jié)果系4次獨立重復(fù)實驗結(jié)果平均值統(tǒng)計，考慮若比較同組不同時間蛋白表達量變化，則該結(jié)果可能存在一定程度系統(tǒng)誤差，故不做討論。DEX對DHC和Dynactin蛋白表達呈現(xiàn)濃度依賴性及時間依賴性。短期、小劑量應(yīng)用DEX是否從對神經(jīng)元遷移角度是安全的，需要進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)DEX對體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元DCH和Dynactin mRNA表達的影響，在所選定的濃度和時間點均無顯著性差異，與蛋白表達的變化不匹配，這可能與DEX對兩種蛋白表達的影響非在轉(zhuǎn)錄水平，而在mRNA翻譯至蛋白的過程有關(guān)，體現(xiàn)出DEX對腦內(nèi)蛋白表達調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，但也可能與選擇的研究時間點使結(jié)果產(chǎn)生偏倚有關(guān)。

總之，DEX影響體外培養(yǎng)胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元DHC和Dynactin蛋白表達，這種影響與劑量的高低、作用時間的長短有關(guān)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。