李志路，李洪海，杜瑩婧，李賽嘉，許冰心,易國(guó)輝，張?jiān)葡?/p>

1.海南醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院(?？?570105);2.海南醫(yī)學(xué)院 科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心(海口 570105);3.海南省創(chuàng)傷與災(zāi)難救援研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(?？?570105)

動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死(atherosclerotic cerebral infarction，ASCI)是指動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成導(dǎo)致腦供血不足，局部腦組織壞死和神經(jīng)功能不可逆性損傷的疾病,具有發(fā)病率高、致殘率高等特點(diǎn)[1]。ASCI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，危險(xiǎn)因素包括炎性反應(yīng)、慢性感染性疾病、高血糖、高血壓、吸煙、飲酒、暴飲暴食、偏頭痛等，但共同特點(diǎn)是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脫落導(dǎo)致血管堵塞[2-6]。動(dòng)脈粥樣硬化(arteriosclerosis，AS)是一種涉及全身大、中動(dòng)脈病變,誘導(dǎo)產(chǎn)生各種缺血性心腦血管疾病，其病灶及斑塊形成與血液中低密度脂蛋白(low-disentylipo-protein,LDL)的代謝及氧化密切相關(guān)[7]。對(duì)氧磷酶1基因(paraoxonase 1，PON1)是一種由肝臟分泌的與高密度脂蛋白(high-densitylipo-protein，HDL)緊密結(jié)合鈣離子依賴型磷脂酶，具有抑制LDL氧化作用，可間接減緩巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成而發(fā)揮抗AS作用[8-9]。PON1基因的遺傳變異可影響其蛋白的結(jié)構(gòu)和數(shù)量，進(jìn)而影響其功能的正常發(fā)揮。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)作為第三代遺傳標(biāo)記廣泛存在于各類物種的基因組中，成為個(gè)體化差異和疾病發(fā)生發(fā)展的遺傳基礎(chǔ)。

據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢發(fā)現(xiàn)，PON1基因中存在1 169個(gè)SNP位點(diǎn)，部分SNPS與不同地區(qū)心腦血管疾病的相關(guān)性研究已被報(bào)道，rs662位點(diǎn)多態(tài)性與江西人群[10]、 -909C/G基因多態(tài)性與包頭漢族人群[11]、-162A/G 基因多態(tài)性與上海漢族人群[12]等關(guān)聯(lián)性研究表明，PON1的遺傳變異與心腦血管疾病具有相關(guān)性。海南本地人群長(zhǎng)期處于孤島，在地理位置上具有相對(duì)隔離性，因而是研究遺傳變異與疾病性狀相關(guān)性的良好的遺傳資料。目前，對(duì)海南漢族中PON1基因與ASCI的相關(guān)性研究甚少[13]。因此，本研究擬以海南ASCI和正常人群為研究對(duì)象，探究PON1基因rs2074354、 rs3917538 和rs854565與ASCI的相關(guān)性，以期為易感人群提供預(yù)警指標(biāo)，為臨床診斷和治療提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年3—12月在海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的142例單純性漢族ASCI患者作為試驗(yàn)組，選擇同期在本院體格檢查科檢查的196例漢族健康人群作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：采樣者均自愿加入本研究，并簽署知情同意書。試驗(yàn)組嚴(yán)格按照《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》[14]的標(biāo)準(zhǔn)納入；試驗(yàn)組納入的樣本除患ASCI外無其余疾病史；對(duì)照組無任何疾病史。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：所有受試者排除癌癥史、心血管疾病、自身免疫性疾病或已知感染性疾病史。試驗(yàn)組男84例，女58例，年齡38～94歲。對(duì)照組男127例，女69例，年齡49～91歲。兩組性別及年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集方法 所有樣本采集乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid,EDTA)抗凝外周血2 mL，試劑盒法提取外周血全基因組DNA，質(zhì)量鑒定。

1.2.2 基因 SNP 位點(diǎn)分型方法 上述樣本為原材料，以上游引物P1(ACGTTGAGTGCTGTAG AAGACCTTCTAGGAGC)和下游引物P2(ACGT TGAGTGCAGCTCAGAGAACAAAGAGG)擴(kuò)增出包含 rs2074354 位點(diǎn)的 91 bp DNA片段，以上游引物P3(ACGTTGAGTGCTGTGTGTGTCTGTG TGTAA)和下游引物P4(ACGTTGAGTGTGTA GGCCCAAGTATGTAGG)擴(kuò)增出包含 rs3917538 位點(diǎn)的 120 bp DNA片段，以上游引物P4(ACGTT GAGTAGTGCAGCATCAGTAGCTTCG)和下游引物P5(ACGTTGAGTGGTCTAGGTAAAGAG CAAAGG)擴(kuò)增出包含 rs854565 位點(diǎn)的110 bp DNA片段。多重PCR擴(kuò)增條件: 95 ℃預(yù)變性3 min、[94 ℃(15 s)、55 ℃(15 s)、72 ℃(30 s)]進(jìn)行35個(gè)循環(huán)、72 ℃延伸3 min。純化產(chǎn)物利用3730XL基因測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定及數(shù)據(jù)讀取。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016錄入整理，使用人工計(jì)算和SNPstats軟件進(jìn)行Hardy-weinberg平衡定律、兩組間基因型分布頻率、等位基因分布頻率、單倍型分析;等位基因用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析，定性資料以例數(shù)(%)表示，組間比較采用2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α除特別說明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組Hardy-Weinberg遺傳平衡驗(yàn)證

Hardy-Weinberg遺傳平衡驗(yàn)證結(jié)果顯示，PON1基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)在兩組漢族人群出現(xiàn)概率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，具有代表性 (表1～2)。

表1 對(duì)照組Hardy-Weinberg遺傳平衡驗(yàn)證

表2 試驗(yàn)組Hardy-Weinberg遺傳平衡驗(yàn)證

2.2 PON1基因3個(gè)SNP基因型、等位基因分型

3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs854565、rs3917538、rs2074354均可檢測(cè)出3種基因型。這3種基因型在兩組中的發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);且3個(gè)位點(diǎn)的等位基因A和G在兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3～4)。

表3 rs2074354、rs3917538、rs854565的基因分型結(jié)果[n(%)]

表4 rs2074354、rs3917538、rs854565等位基因分型結(jié)果[n(%)]

2.3 試驗(yàn)組PON1基因3個(gè)SNP的單倍型分析

rs2074354-rs3917538-rs854565單倍型G-G-A、G-G-G、G-A-G均與漢族ASCI的發(fā)生無相關(guān)性(P>0.05)(表5)。

表5 試驗(yàn)組PON1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)單倍型分析

3 討論

血漿LDL參與細(xì)胞內(nèi)的氧化代謝，在人體中通過觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)影響AS過程，包括內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種靶細(xì)胞的反應(yīng)，其信號(hào)傳導(dǎo)能力與LDL及其受體的含量相關(guān)聯(lián)[15-16]。PON1基因的編碼區(qū)定位于人類染色體Ⅶ號(hào)臂21.3～22.1上，是一種存在于哺乳動(dòng)物HDL中Ca2+依賴血清酯酶，其通過保護(hù)LDL不被氧化，從而提高HDL在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)中抗AS作用，降低LDL形成巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞促AS作用[17]。已有研究[18]報(bào)道，亞洲人ASCI的發(fā)病原因以顱內(nèi)AS多見，而歐美人則大多為顱外AS，且ASCI由AS引起為主的觀點(diǎn)已成共識(shí)。此外，從基因遺傳變異的角度挖掘其發(fā)病機(jī)制，可以幫助更多的研究者在基因組水平上揭示疾病的發(fā)病機(jī)制及尋找新的靶向治療位點(diǎn)。關(guān)于基因與ASCI的關(guān)聯(lián)性研究主要集中在PON1、CD147、MMP-12、LRP6等基因上，且在不同人群中發(fā)現(xiàn)其與ASCI存在不同程度的關(guān)聯(lián)性[19-20]，但關(guān)于PON1基因多態(tài)性與ASCI的關(guān)聯(lián)性研究甚少，基于此本實(shí)驗(yàn)遴選PON1基因3個(gè)SNP與海南ASCI關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了探究。

本試驗(yàn)的3個(gè)SNP位點(diǎn)rs2074354、rs3917538、rs854565均位于Ⅶ號(hào)染色體上,具體位置分別為第95311275 bp、第95308581 bp、第95319032 bp。rs2074354屬于PON1基因內(nèi)含子突變，分析等位基因聚合分析計(jì)劃的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示等位基因A的全球發(fā)生頻率為10.9%, 歐洲人群A的分布頻率為9.5%，亞洲人群中A的分布頻率達(dá)到46.1%，而在東亞人群中為48.5%。本研究結(jié)果顯示，漢族人群中等位基因A的分布頻率為45.9%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全球分布頻率，與亞洲人群及東亞人群中A的分布頻率相接近。

多態(tài)性位點(diǎn)rs3917538也屬于PON1基因內(nèi)含子突變，分析等位基因聚合分析計(jì)劃的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，等位基因A的全球發(fā)生頻率為24.6%, 歐洲人群接近全球水平(22.8%)，亞洲人群中A的分布頻率達(dá)到57.0%，而在東亞人群中為59.2%，本次研究結(jié)果顯示，漢族人群中等位基因A的分布頻率為53.32%，遠(yuǎn)高于全球分布頻率，與亞洲人群及東亞人群中A的分布頻率相接近。關(guān)于位點(diǎn)rs2074354和rs3917538，在Sikora等[21]關(guān)于多酚攝入與心血管疾病標(biāo)志物上的PON1基因變異之間的相互作用的研究中有所提及，該項(xiàng)研究表明，在意大利人群中PON1作為對(duì)心血管健康的易感基因在攝入不同量高抗氧化劑的情況下，rs2074354和rs3917538對(duì)心血管疾病具有一定的保護(hù)作用。

多態(tài)性位點(diǎn)rs854565同屬于PON1基因內(nèi)含子突變，分析等位基因聚合分析計(jì)劃的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，等位基因A的全球發(fā)生頻率為69.3%, 歐洲人群接近全球水平(69.2%)，亞洲人群中A的分布頻率達(dá)到70%，而在東亞人群中為50%，本研究結(jié)果顯示，漢族人群中等位基因A的分布頻率為30.87%，遠(yuǎn)低于與亞洲人群及東亞人群中A的分布頻率，這個(gè)研究結(jié)果可能是因?yàn)榭绲赜蛉巳旱牟町悓?dǎo)致，也正體現(xiàn)了海南漢族人群在rs854565的多態(tài)性的進(jìn)化上相對(duì)獨(dú)立；也可能是樣本量太小導(dǎo)致，可以擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。相關(guān)學(xué)者[22-23]通過對(duì)rs854565等位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，血清對(duì)氧磷酶活性與PON基因簇中的變異和阿爾茨海默氏病及散發(fā)性ALS的發(fā)病率均有所關(guān)聯(lián)。Kim等[24]相關(guān)研究表明，在西雅圖人群中PON基因簇中rs2074354和rs3917538在內(nèi)的PON基因雖可預(yù)測(cè)PON1活性，但不能預(yù)測(cè)血管疾病。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，rs2074354、rs3917538、rs8545653這3個(gè)位點(diǎn)與海南ASCI的關(guān)聯(lián)性較弱。研究人群的選擇和樣本量的大小可能會(huì)影響本研究結(jié)果，對(duì)于這些問題，將在今后的研究中使用更大的樣本量對(duì)多項(xiàng)研究結(jié)果進(jìn)行匯總分析。因此，在后續(xù)的研究中可以考慮納入更多的樣本及更多的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，以期尋找ASCI的易感位點(diǎn)，為ASCI的診斷、防治提供參考依據(jù)。