李文鳳,王標詩,余石堅,陳舒琪,楊勝遠,胡小軍,彭元懷,江 敏,馬景球

(嶺南師范學院食品科學與工程學院,廣東湛江 524048)

我國漁業(yè)經濟結構與生產規(guī)模越來越大,但在漁業(yè)供求鏈不斷提高的同時會產生大量的下腳料廢棄物,其中包含大量的魚鱗,其對環(huán)境凈化造成一定的壓力[1-2]。經研究分析魚鱗中的成份主要為生物性高分子膠原蛋白和羥基磷灰石,越來越多的學者以魚鱗為原料提取膠原蛋白,進而開發(fā)藥用明膠產品，這拓展了其在保健食品、醫(yī)藥和化妝美容等方向的應用，是近年來的研究熱潮[3-5]。吳凌濤等[6]對十種淡水魚進行研究分析,得出鱸魚和黃花魚營養(yǎng)價值較高的結論。而黃花魚作為我國四大海洋漁業(yè)品種之一,生長分布廣泛,具有很好的食療作用,長期以來深受消費者的喜歡[7-8]。黃花魚除鮮食外,還可加工成魚罐頭、魚糜等系列產品,在鮮食和加工過程中魚鱗一般被制成飼料或作為廢棄物進行處理,魚鱗中含有豐富的膠原蛋白,對黃花魚魚鱗進行合理研究利用,能提高魚類加工副產物的附加值,進一步增大其經濟效益。

魚鱗是由三螺旋結構的膠原蛋白和羥基磷灰石共同形成的纖維板層結構,其中膠原被磷灰石黏附,因此提取魚鱗膠原蛋白之前,魚鱗必須脫灰脫鈣,而且脫鈣越徹底,膠原蛋白的質量越高[9]。據(jù)目前研究,有關魚鱗脫鈣工藝的研究方法主要有酸法(鹽酸、檸檬酸、乳酸等)、熱水提取法和EDTA法,以及其他物理輔助脫鈣法(超聲波、微波、磁力攪拌等)[10]。蔣柏泉等[11]在單因素基礎上建立動力學方程,以鹽酸為脫鈣劑得到最優(yōu)工藝條件下鳙魚魚鱗脫鈣率為86.20%。彭元懷等[12]以檸檬酸為脫鈣劑對羅非魚魚鱗進行脫鈣,運用EDTA 絡合滴定法在單因素基礎上利用正交設計進行實驗優(yōu)化分析,脫鈣率達96.13%。王梅英等[13]通過采用二次通用旋轉組合設計進行超聲波輔助羅非魚魚鱗鹽酸脫鈣的優(yōu)化試驗,在最優(yōu)工藝條件下脫鈣率達到92.43%?？梢?不同的方法對魚鱗脫鈣效果有一定差異。

對于魚鱗脫鈣工藝的研究,淡水魚中羅非魚[12-13]和四大家魚(青魚草魚鰱魚和鳙魚)[14-17]都有相關研究報道,海水魚中(如沙丁魚[18])也有部分報道,尚未見對黃花魚魚鱗脫鈣的相關報道,而物理場輔助酸法對魚鱗脫鈣相關的報道也較少。使用的脫鈣劑多為檸檬酸和鹽酸,考慮到安全性和成本等因素,本試驗以檸檬酸為脫鈣劑,利用超聲波對液體產生的空化作用而使液體瞬間獲得巨大壓力來改變魚鱗脫鈣效果,考查料液比、檸檬酸濃度、超聲時間這三因素對黃花魚魚鱗脫鈣率的影響,并通過響應面Box-Behnken試驗原理對魚鱗脫鈣進行優(yōu)化分析,以期為黃花魚魚鱗膠原蛋白的提取提供參考條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃花魚魚鱗 收集于湛江市東風市場;碳酸鈣、鹽酸、氨水、氯化銨、鉻黑T、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、氫氧化鈉、無水乙酸鈉等 均為分析純。

FA2104N-電子天平 上海精科天美科學儀器有限公司;PHS-3C精密酸度計 上海精研電子科技有限公司;BAO-50A精密鼓風干燥箱 施都凱儀器設備(上海)有限公司;JY92-ⅡN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;HZS-HA水浴振蕩器 廣州市德科生物科技有限公司;210 mm干燥器 臺州市偉新糧檢儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚鱗脫鈣工藝 將收集的魚鱗用清水多次沖洗并去除雜質,于35 ℃干燥箱鼓風干燥24 h后儲存于干燥器備用;將干燥的魚鱗剪成細小碎片,稱取一定量加入一定體積和濃度的檸檬酸溶液,在超聲波功率為450 W條件下處理一定時間后,過濾、取濾液備用。

1.2.2 單因素實驗設計 在超聲波功率為450 W條件下,以脫鈣率為指標,固定檸檬酸濃度為10%,超聲時間為60 min,探究料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對魚鱗脫鈣的影響;固定液料比為1∶20 (g/mL),超聲時間為60 min,探究檸檬酸濃度(6%、8%、10%、12%、14%)對魚鱗脫鈣的影響;固定液料比為1∶20 (g/mL),檸檬酸濃度為10%,探究超聲時間(30、45、60、75、90 min),此時間為實際超聲總時間,不包括間歇時間,操作中每超聲工作2 s,間歇2 s)對魚鱗脫鈣的影響。

1.2.3 響應面試驗設計 在單因素實驗基礎上,以料液比(X1)、檸檬酸濃度(X2)、超聲時間(X3)這3個因素為自變量,脫鈣率(Y)為響應值,采用響應面中Box-Behnken試驗原理進行三因素三水平試驗。因素水平編碼見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 脫鈣率的測定

1.2.4.1 魚鱗中總鈣含量的測定 按照GB 5009.92-2016食品安全國家標準 食品中鈣的測定,具體操作如下。將晾干的魚鱗剪碎準確稱取一定量,按照1∶20的料液比加入1 mol/L的鹽酸溶液,在室溫下進行處理24 h后將液體轉移至100 mL容量瓶并定容,用EDTA(0.001 mol/L)溶液進行滴定。試樣的總鈣含量按下式計算:

式中,X-樣液中的總鈣含量,mg/kg;T-EDTA-2Na滴定度,mg/mL;V1-滴定樣液時所消耗的EDTA-2Na(0.001 mol/L)溶液的體積,mL;V0-滴定空白液時所消耗的EDTA-2Na(0.001 mol/L)溶液的體積,mL;V2-樣液總體積,mL;m-試樣質量,g;V3-滴定用樣液的體積,mL;1000—換算系數(shù)。

1.2.4.2 鈣離子標準曲線的繪制 參考肖莉等[14]實驗方法。準確稱取經干燥處理的基準碳酸鈣2.5000 g于250 mL燒杯中,緩慢加入少量的鹽酸(6 mol/L)進行溶解,定容于1000 mL容量瓶。準確吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00 mL脫鈣液于250 mL錐形瓶中,加蒸餾水至50 mL,依次加入15 mL氨水緩沖液,3滴鉻黑T,搖勻后用0.01 mol/L的EDTA-2Na標準溶液滴至溶液變?yōu)樗{色,記錄消耗EDTA-2Na的體積。分別以EDTA-2Na的消耗體積和鈣離子濃度為橫縱坐標繪制鈣離子標準曲線,得到該曲線的線性回歸方程。

1.2.4.3 脫鈣率的計算 取1 mL脫鈣后的濾液與錐形瓶中。按照1.2.4.2的操作進行滴定得到反應消耗EDTA-2Na的體積,并通過1.2.4.2得到的線性回歸方程計算鈣離子濃度,按下式計算脫鈣率:

式中,Y-魚鱗脫鈣率,%;ρ-由標準曲線得到的鈣離子濃度,mg/mL;V-檸檬酸體積,mL;F-滴定時稀釋倍數(shù);m-黃花魚魚鱗質量,g;H-魚鱗總鈣含量,mg/kg。

1.2.5 魚鱗膠原蛋白損失率測定 羥脯氨酸是膠原蛋白的氨基酸組成之一,其與膠原蛋白的含量成正相關關系,故通過測定羥脯氨酸含量可間接計算出膠原蛋白的損失率值[19-20]。參照國標GB/T 9695.23-2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》的方法,分別測得脫鈣液中的羥脯氨酸含量N和魚鱗中羥脯氨酸含量M,再按照以下公式進行黃花魚魚鱗脫鈣后膠原蛋白的損失率Y(%)計算:

式中,Y-膠原蛋白損失率,%;N-羥脯氨酸含量,%;M-魚鱗中羥脯氨酸含量,%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的試驗至少進行三次,根據(jù)三次試驗結果計算相應的標準偏差。結果以均值或均值(標準偏差的形式表示。應用Excel軟件進行繪圖,Design-Expert V8.0.6軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 鈣離子標準曲線

鈣離子標準曲線見圖1。根據(jù)鈣離子標準曲線得出回歸方程為:y=0.0198x-0.0007,式中y為鈣離子濃度,mg/mL;x為EDTA-2Na消耗體積,mL;決定系數(shù)R2為0.9999,表明EDTA-2Na消耗體積和鈣離子濃度有良好線性關系。

圖1 鈣離子標準曲線Fig.1 Calcium ion standard curve

2.2 羥脯氨酸標準曲線

羥脯氨酸標準曲線見圖2,以吸光度(扣除空白)為縱坐標、羥脯氨酸濃度為橫坐標,繪制標準曲線,根據(jù)測定結果計算回歸方程為 y=0.2068x+0.0076,決定系數(shù)R2為0.9994,顯示吸光度與羥脯氨酸濃度有良好的線性關系。

圖2 羥脯氨酸標準曲線Fig.2 Standard cuve of Hyp

圖3 料液比對黃花魚魚鱗脫鈣的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on decalcification rate of yellow croaker scales

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 料液比對魚鱗脫鈣的影響 料液比對黃花魚魚鱗脫鈣的影響結果見圖3。由圖3可以看出,料液比小于1∶20時,隨著料液比的增加魚鱗脫鈣率明顯升高,可能是溶液體積增大,使得魚鱗更加分散,增大了檸檬酸與羥基磷灰石的接觸表面積,從而促進脫鈣。當料液比超過1∶20后,進一步增加料液比,脫鈣率有降低的趨勢,可能魚鱗中鈣離子對檸檬酸的需求基本達到飽和狀態(tài)[15],再增加料液比,反而不利于魚鱗脫鈣。因此選取液料比為1∶20 g/mL較合適。

2.3.2 檸檬酸濃度對魚鱗脫鈣的影響 檸檬酸濃度對黃花魚魚鱗脫鈣的影響結果見圖4。由圖4可以看出,脫鈣率隨著檸檬酸濃度的增高有先升后降的趨勢,在濃度為10%時有較高脫鈣率,相比濃度為6%時的脫鈣率,兩者結果相差9.32%,說明檸檬酸濃度對脫鈣率有較大影響,在濃度較低時,提高反應物的濃度,有利于鈣離子與檸檬酸反應生成檸檬酸鈣,進而促進脫鈣。在檸檬酸濃度達到10%時,此時體系中的檸檬酸已經能夠滿足鈣離子的反應需求,體系已趨于平衡[15],此時提高檸檬酸濃度,對脫鈣反而不利從而降低了魚鱗脫鈣率。因此選取檸檬酸濃度為10%較適。

圖4 檸檬酸濃度對黃花魚魚鱗脫鈣的影響Fig.4 Effect of citric acid concentration on decalcification rate of yellow croaker scales

2.3.3 超聲時間對魚鱗脫鈣的影響 超聲時間對黃花魚魚鱗脫鈣影響的結果見圖5。由圖5可以看出,超聲時間小于60 min時,脫鈣率隨著時間的變化明顯升高,說明魚鱗中的鈣溶出到與檸檬酸反應需要一定時間;當脫鈣時間超過60 min 后,進一步提高反應時間,而脫鈣率反而降低,說明過長時間超聲處理反而不利于魚鱗脫鈣。因此選取超聲時間為60 min較適。

圖5 超聲時間對黃花魚魚鱗脫鈣的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on decalcification rate of yellow croaker scales

2.4 響應面試驗

2.4.1 模型的建立與分析 以料液比(X1)、檸檬酸濃度(X2)和超聲時間(X3)為試驗因素,魚鱗脫鈣率Y(%)為評價指標,運用Design-Expert V8.0.6 Box-behnken進行響應面設計,其試驗設計及結果見表2。

表2 試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results

對表2進行回歸分析得到試驗因素與脫鈣率的方程式如下:

對上述回歸模型進行方差分析和回歸系數(shù)的顯著性檢驗,結果見表3。由表3中方差分析可知,回歸模型的失擬項P=0.0640>0.05,說明該模型計算不存在顯著誤差,所得方程與實際擬合良好;模型的復決定系數(shù)R2值為0.9927,擬合度>90%,表明該模型與實驗擬合程度較好,能合理描述響應值的變化過程。因此可利用該模型對黃花魚魚鱗脫鈣提取率進行分析和預測。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗Table 3 Variance analysis and their significance test of its coefficients for the regression model

圖6 檸檬酸濃度與超聲時間對脫鈣率影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour line showing the interactive effect of citric acid concentration and ultrasonic time on decalcification rate

圖7 檸檬酸濃度和料液比對脫鈣率影響的響應面和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour line showing the interactive effect of citric acid concentration and solid-liquid ratio on decalcification rate

圖8 超聲時間和料液比對脫鈣率影響的響應面和等高線圖Fig.8 Response surface plot and contour line showing the interactive effect of ultrasonic time and solid-liquid ratio on decalcification rate

2.4.2 響應曲面圖型分析 圖6是料液比為1∶20的條件下輔以450 W功率的超聲波進行魚鱗脫鈣,檸檬酸濃度-超聲時間與魚鱗脫鈣率關系的響應曲面圖和等高線圖。從圖6可知,當超聲時間為60 min以下某一固定值,檸檬酸濃度在6%～10%范圍時,脫鈣率隨檸檬酸濃度增高而增高;當超聲時間為60 min以上某一固定值,檸檬酸濃度在10%～14%范圍時,脫鈣率隨檸檬酸濃度增高而降低。通過檢驗結果P=0.2087(P>0.05),顯示檸檬酸濃度與超聲時間的交互作用對魚鱗脫鈣率的影響不顯著。

圖7是超聲時間為60 min的條件下輔以450 W功率的超聲波進行魚鱗脫鈣,檸檬酸濃度-料液比與魚鱗脫鈣率關系的響應曲面圖和等高線圖。從中可知,在檸檬酸濃度為8%～12%,料液比為1∶15～1∶25區(qū)間時,脫鈣率有最大閾。P=0.6264(P>0.05),顯示檸檬酸濃度與料液比的交互作用對魚鱗脫鈣率的影響不顯著。

圖8是檸檬酸濃度為10%的條件下輔以450 W功率的超聲波進行魚鱗脫鈣,超聲時間-料液比與魚鱗脫鈣率關系的響應曲面圖和等高線圖。從中可知,超聲時間較短時,適當增大料液比能提高脫鈣率;超聲時間較長時,過大的料液比比值反而降低脫鈣率。通過檢驗結果P=0.1349(P>0.05),顯示超聲時間與料液比的交互作用對魚鱗脫鈣率的影響不顯著。響應面模型中的曲面投影形狀可以反映出考查因素間交互效應的強弱,圖形的形狀近似圓形能體現(xiàn)出各個因素之間的交互作用不是很顯著[21]。圖7和圖8等高線更接近于圓形,也說明其交互作用不顯著。

2.4.3 提取條件的優(yōu)化與驗證 經過實驗統(tǒng)計軟件Design-Expert. V8.0.6對數(shù)據(jù)進行分析擬合,得到黃花魚魚鱗脫鈣最優(yōu)工藝條件:料液比為1∶19.28,檸檬酸濃度為10.55%,超聲時間為65.56 min,響應面模型預測的脫鈣率為99.33%。結合實驗室實際情況及方案實施的可操作性,對上述工藝條件進行調整為:料液比1∶19,檸檬酸濃度10.5%,超聲時間為65 min,以此條件在功率為450 W的超聲下進行三次平行試驗測得實際脫鈣率為99.18%±0.14%,說明該方程與實際情況擬合良好,實際值與預測值的誤差約為0.15%,誤差較小,可能是由于條件差異導致。此數(shù)據(jù)也高于試驗中的最高值99.02%,因而說明運用響應面法優(yōu)化黃花魚魚鱗脫鈣工藝的方法相對較為合理,得到擬合方程適用于對黃花魚魚鱗脫鈣工藝條件進行參數(shù)優(yōu)化和分析。

2.4.4 最優(yōu)條件下魚鱗脫鈣膠原蛋白的損失率結果 在最優(yōu)條件工藝下對魚鱗脫鈣液測定膠原蛋白含量,進行三次平行試驗,最終得到膠原蛋白損失率為4.08%±0.36%,膠原蛋白損失不大。因此表明超聲波輔助檸檬酸對黃花魚魚鱗的膠原蛋白影響較小,可以對魚鱗中鈣進行有效脫除能進行工藝優(yōu)化,這將為黃花魚魚鱗進行下一步提取膠原蛋白的研究提供很好的基礎。

3 結論

通過響應面法設計建立了魚鱗脫鈣的液料比、檸檬酸濃度和超聲時間三因素的回歸模型,表明該模型與實驗擬合程度較好,可利用該模型對黃花魚魚鱗脫鈣提取率進行分析和預測。三個自變量對魚鱗脫鈣率的影響大小的結果依次為:超聲時間>料液比>檸檬酸濃度。通過優(yōu)化分析得出黃花魚魚鱗最佳脫鈣工藝條件為:在超聲波功率450 W下,料液比為1∶19,檸檬酸濃度為10.5%,超聲時間為65 min,在此條件下魚鱗脫鈣率高為99.18%±0.46%,膠原蛋白損失率為4.08%±0.36%,說明超聲波輔助可以有效提高檸檬酸對黃花魚魚鱗脫鈣效果,而且對魚鱗膠原蛋白的損失極小,這為后續(xù)提取魚鱗膠原蛋白奠定了好的基礎。