屈 云,賀蘇皖,趙燕英,施春雷,陳 娟,于基成,唐俊妮,*

(1.西南民族大學食品科學與技術學院,青藏高原動物遺傳資源保護 與利用教育部重點實驗室,四川成都 610041; 2.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院中美食品安全聯(lián)合研究中心,上海 200240; 3.大連民族大學生物技術與資源利用教育部重點實驗室,沈陽大連 116600)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是社區(qū)和醫(yī)院臨床感染最為常見的病原體之一,也是污染食品引發(fā)食物中毒的主要致病菌。該類菌株能分泌一系列酶如核酸酶、透明質(zhì)酸酶等,這些酶能將局部宿主組織轉變成細菌生長的營養(yǎng)成分[1]。一些菌株還能產(chǎn)生多種毒性蛋白,包括腸毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)、休克綜合征1型毒素(toxic shock syndrom toxin-1,TSST)、剝脫毒素(exfoliatin,ET)、溶血素(hemolysin,HL)和殺白細胞素(panton-valentine leucocidin,PVL)等,可引起急性金黃色葡萄球菌毒血癥和食物中毒[2-3]。尤其是攜帶編碼青霉素結合蛋白基因mecA的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA),表現(xiàn)出對多種抗生素耐藥。因此,金黃色葡萄球菌感染給臨床治療帶來困難,特別是MRSA感染,成為世界范圍內(nèi)較難治療的感染性疾病之一[4]。目前,MRSA菌株在世界各地的醫(yī)院、社區(qū)、養(yǎng)殖場,動物性食品中廣泛流行,成為備受關注的“超級細菌”[5]。要弄清楚MRSA的傳播特征,分子分型技術非常重要。葡萄球菌染色體基因盒mec(Staphylococcal Cassette Chromosomemec,SCCmec)分型、葡萄球菌A蛋白(spa)分型和多位點序列(Multilocus sequence typing,MLST)分型作為研究MRSA在人-畜-食品傳播途徑的重要依據(jù),是MRSA流行病學調(diào)查研究的重要工具[3]。來自家畜及其相關衍生食品中MRSA的檢出被不斷報道,屠宰攜帶MRSA的動物以及感染MRSA的人員處理食品時都可能會造成食物的污染,對人類健康造成巨大威脅[6-7]。所以針對畜禽肉中MRSA的污染調(diào)查非常必要。本文主要針對成都市生鮮豬肉樣品中分離出的MRSA菌株進行流行特征分析,為成都市MRSA的傳播途徑研究及防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2×TSINGKE Master Mix、核酸染料GELVIEW、DL2000 Marker 擎科梓熙生物技術有限公司;無水乙醇 成都海興化學試劑廠;1×TE緩沖液;1×TAE緩沖液、甘油 天津市瑞金特化學品有限公司;Tris飽和酚 北京博奧拓達科技有限公司;1%亞碲酸鉀卵黃增菌液、Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、Muller-Hinton(MHA)瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基、Muller-Hinton Borth(MHB)培養(yǎng)基、7.5%氯化鈉肉湯、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司;G-10電泳凝膠瓊脂糖 Biowest公司;氫氧化鈉、氯化鈉(分析純) 福晨化學試劑有限公司;抗生素藥敏片 Oxoid公司。

DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠;5804R型Eppendorf 冷凍離心機 Eppendorf中國有限公司;WD800B型微波爐 順德市格蘭仕微波爐電器有限公司;PTC-200PCR儀、UniversalHood Ⅱ型凝膠成像儀 Bio-Rad公司;SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;MLS-3020 電熱自動滅菌鍋 日本SANYO公司;UV-6100分光光度計 上海美普達儀器有限公司;GHP-9080水式恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學儀器有限公司;HZQ-F160 恒溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇省太倉市實驗設備廠;AKHL-Ⅲ-24艾柯超純水機 成都康寧實驗專用純水設備。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株來源及鑒定 2017年秋～2018年夏,按照隨機抽樣法分別從四川省成都市七個行政區(qū)食品市場采集生鮮豬肉樣品若干份,依照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》(GB 4789.10-2010)[8]分離鑒定出金黃色葡萄球菌共計297株(由本實驗室保存)。采用文獻報道的酚-氯仿-異戊醇法提取細菌DNA[9]。以編碼青霉素結合蛋白的基因mecA作為MRSA的判定,并以攜帶該基因的MRSA ATCC43300為參考菌株,采用mecA基因引物對分離菌株進行PCR鑒定[10]。引物序列如下:mecA-F:5′-TGGCTCAGGTACTGCTATCC-3′;mecA-R:5′-CACCTTGTCCGTAACCTGAA-3′。

PCR反應體系:2×TSINGKE Master mix 10 μL;上下游引物各0.4 μL;DNA 模板1 μL;ddH2O 8.2 μL;共20 μL體積,理論片段長度556 bp。

PCR反應程序:98 ℃預變性2 min;98 ℃變性20 s;56 ℃退火10 s;72 ℃延伸30 s;共35個循環(huán),72 ℃延伸2 min。將PCR擴增陽性結果送至上海生工有限公司進行測序,測序結果使用clustalx183軟件進行多序列比對,并采用MEGA V7.0.26軟件構建進化樹。

表1 SCCmec分型引物序列Table 1 SCCmec typing primer sequence

1.2.2 SCCmec、spa及MLST分型 SCCmec分型是根據(jù)SCCmec染色體盒中不同組成元件的復雜排列順序來進行分型[11],MLST聯(lián)合SCCmec分型方法最初由Enright等[12]建立,該分型方法能夠將MRSA克隆株、遺傳背景和進化有機地結合起來[13]。另外,編碼葡萄球菌蛋白A的spa基因的X區(qū)域具有良好的穩(wěn)定和重復性,spa分型也被廣泛用于研究不同地區(qū)金黃色葡萄球菌的爆發(fā)流行[14]。因此,本研究采用以上三種分型方法對MRSA菌株進行分型探究。

1.2.2.1 SCCmec分型 MRSA菌株SCCmec分型引物序列及擴增條件見參考文獻[15],DNA模板制備同上,PCR體系同1.2.1。對陽性擴增產(chǎn)物進行測序比對。

1.2.2.2spa基因分型 引物序列:spa-F:5′-TAA AGA CGA TCC TTC GGT GAG C-3′;spa-R:5′-CAG CAG TAG TGC CGT TTG CTT-3′[16]。DNA模板制備同上,PCR體系同1.2.1,產(chǎn)物進行測序分析,測序結果使用DNAMAN軟件進行比對拼接分析,從而得到菌株的spa基因分型。

1.2.2.3 MLST分型 多位點序列分型(Multiple-locus sequence typing,MLST)通過直接測定MRSA的7個管家基因(aroE、arcC、gmk、pta、glpF、tpi和yqiL)的核苷酸序列進行。引物序列及反應條件見表2,DNA模板制備與PCR體系配制同1.2.1。擴增產(chǎn)物進行1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳處理,將結果進行雙向測序并拼接。用每個菌株的7個拼接片段在MLST數(shù)據(jù)庫中進行搜索配對,得到7個管家基因相對應的基因編號,再進行匹配得到菌株對應的ST編號。

表2 MLST分型引物序列Table 2 MLST typing primer sequences

1.2.3 MRSA攜帶相關特征基因的檢測 針對腸毒素基因[17-18]、其他毒力基因[12,19-20]、耐抗菌藥物基因[21-25]、耐消毒劑基因[26]及生物被膜形成相關基因[27]的檢測,按照文獻報道的引物序列,進行引物的合成和PCR擴增。細菌DNA模板的制備方法同上,PCR體系同1.2.1。產(chǎn)物進行1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳,并對陽性擴增產(chǎn)物進行測序確認。

1.2.4 抗生素敏感性實驗 采用金黃色葡萄球菌ATCC6538為藥敏實驗陽性對照,根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and laboratory standards in stitute,CLSI[28])推薦的K-B紙片擴散法進行操作,實驗結果按照CLSI的標準進行判定。所用抗菌藥物及濃度見表3。

表3 22種抗生素藥物及其使用濃度Table 3 22 antibiotics and their concentration in this study

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel、SPSS 22.0軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 豬肉源MRSA菌株的鑒定

PCR結果顯示,從297株生鮮豬肉源金黃色葡萄球菌中,檢測出攜帶mecA基因的菌株有24株(圖1A),MRSA的分離率為8.08%(24/297)。進一步對24份陽性擴增產(chǎn)物進行測序比對,并采用DNAMAN軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果顯示:24株MRSA分離株與NCBI網(wǎng)站上報告的參考菌株mecA基因具有高度同源性(圖1B)。

圖1 mecA基因檢測PCR電泳圖(A) 和mecA基因測序比對結果(B)Fig.1 The PCR electrophoresisof mecA gene(A) and the result of mecA gene sequencing comparison(B)注:圖A泳道1～24:MRSA分離菌株1～24; 泳道M:DL2000Marker;泳道N:陰性對照;泳道P: 陽性對照,以MRSA參考菌株ATCC43300為陽性對照。

2.2 MRSA的分型結果

根據(jù)三種分型方法的分析結果表明:24株豬肉源MRSA分離菌株的主要MLST類型為:ST88(50%)、ST59(16.67%)和ST9(16.67%),另外,4株未鑒定出MLST型別;spa分型結果包括12株T1376、6株T437、3株T3433、以及T2310、T899、T3515各1株;分離株SCCmec分型主要集中于SCCmecIva和SCCmecIVb型,其中,還發(fā)現(xiàn)SCCmecV及SCCmecIII各1株,4株未鑒定出SCCmec型別。具體的分型分析結果見表4。

表4 MRSA菌株分型結果Table 4 MRSA strains typing results

2.3 MRSA菌株的藥敏結果以及攜帶相關特征基因的檢測結果

24株豬肉源MRSA菌株藥敏試驗結果表明:不同菌株間存在差異,除MRSA14和MRSA20外,其余的22株菌株(91.67%,22/24)具有多重耐藥性(3～11)。所有菌株都對青霉素G和氨芐西林表達出抗性,對其他抗生素如四環(huán)素、紅霉素、頭孢西丁等也存在不同程度的耐藥現(xiàn)象,具體見表5。

MRSA菌株耐抗菌藥物相關基因的檢測結果表明:24株MRSA中,氟喹諾酮類耐藥基因陽性檢出率較高norA、grlA檢出率分別為100.00%(24/24)和75.00%(18/24);其次為氨基糖苷類(aac6′/aph2′),攜帶率為75.00%(18/24);大環(huán)內(nèi)脂類(ermB,ermC)陽性檢出率分別為62.50%(15/24)、54.17%(13/24)。此外,氯霉素類(chlA)也有部分檢出,攜帶率為33.33%(8/24)。PCR檢測結果顯示:62.5%(15/24)的菌株攜帶耐消毒劑基因。其中,qacG基因攜帶率為50.00%(12/24);qacC基因攜帶率為20.83%(5/24);qacA/B和qacH的陽性檢出率均為4.17%(1/24)。其中,MRSA17菌株同時攜帶三種耐消毒劑基因(qacA/B+qacC+qacG)。

針對腸毒素基因的檢測結果表明:24株MRSA菌株中共13種腸毒素基因被檢出。其中,攜帶完整的egc腸毒素基因簇(seg,seu,sei,sem,seo,sen)的菌株有兩株(MRSA8和MRSA13);33.33%(8/24)的菌株攜帶有傳統(tǒng)腸毒素A～E基因(sea～see);79.17%(19/24)的菌株攜帶溶血素基因(hla或hlb),其中,8株同時攜帶兩種溶血素基因(hla+hlb)。

針對生物被膜形成相關基因的檢測結果表明:共10種生物被膜形成相關基因被檢出,每株菌株生物被膜形成相關基因的攜帶情況在5～10種之間。其中clfB、eno、icaBC、ebps和sasG在24株MRSA中的檢出率為100%;fib和icaAD檢出率均為95.83%(23/24);sasC(18/24,75.00%);cna(8/24,33.33%)和fnbA(3/24,12.5%)。具體檢測結果詳見表5。

表5 MRSA菌株耐藥表型和毒力基因分布Table 5 The drug resistance phenotype and virulent genes distribution of 24 MRSA strains

3 討論

本研究從成都市七個行政區(qū)的不同市場采集生鮮豬肉樣本,一共分離得到24株MRSA菌株。MLST分型結果顯示成都市豬肉源MRSA菌株主要以ST9、ST59和ST88型為主;SCCmec分型主要為SCCmecIva和SCCmecIVb;spa分型以t437、t1376 和t3433 為主要類型?？梢?ST59-t437-IVa、ST9-t3433-IVb和ST88-t1376-IVa為成都市豬肉源MRSA的主要流行克隆株。

本研究中,MRSA的分離率為8.08%,這一結果對比學者之前對廣東、河南和上海豬源MRSA的檢出率3.6%～33.2%[29-33],說明各地區(qū)豬源MRSA的流行存在地域差異。為了區(qū)分MRSA的流行源頭,學者們將MRSA菌株分為:醫(yī)院相關的MRSA(HA-MRSA)、社區(qū)相關的MRSA(CA-MRSA)和與家畜相關的MRSA(LA-MRSA)[34]。2005年以前,雖然在牛及寵物上分離獲得少量LA-MRSA,但未引起重視。直到發(fā)現(xiàn)LA-MRSA通過環(huán)境或食物鏈向人傳播才引起廣泛關注[35]。近年來LA-MRSA感染人的病例報道不斷在全球范圍內(nèi)出現(xiàn),人們逐漸意識到它是一類重要的人畜共患病原菌。亞洲地區(qū)對LA-MRSA的報道主要集中在中國、日本、韓國等。LA-MRSA一般主要以歐洲國家的ST398和亞洲的ST9 流行菌株為主[36]。中國的ST9優(yōu)勢菌株被鑒定為t899-SCCmecIII和t899-SCCmecIVb或V,以及臺灣的t899-untyped SCCmec[37]。Wagenaar等[38]曾在四川省等部分豬場圈舍塵土中分離到MRSA,優(yōu)勢克隆菌株也為 ST9,并存在變異體 ST1376。結合Wang等[39]和李君[40]的研究進一步表明ST9-t899是我國豬源相關的MRSA主要流行型別。本研究中也檢出了4株ST9型MRSA菌株,同時也檢出了12株ST88和3株ST59型,ST88常被描述為非洲相關流行克隆株[41-42],這說明成都市豬源MRSA菌株分布類型可能在發(fā)生變化,且以ST9、ST88和ST59克隆型傳播。本次研究中分離出的ST88菌株幾乎都存在多重耐藥情況,這一結果與其他學者研究發(fā)現(xiàn)ST88 對β-內(nèi)酰胺類、紅霉素、克林霉素等具有較強的抗性的結果相一致[43-44]。Sun等[44]的報道的一株ST88譜系的CA-MRSA菌株攜帶基因組島νSaα、νSaβ、νSaγ和ΦSa3,以及攜帶編碼中毒性休克綜合征毒素的基因致病島νSa2,超抗原腸毒素SEC和SEL,說明ST88譜系的MRSA具有很強的毒力系統(tǒng),應加以重視。張強等[45]對來源于陜西的12株豬源MRSA ST9進行分型研究,發(fā)現(xiàn)全部為IVb-t899,這與本研究發(fā)現(xiàn)的4株ST9菌株中3株均為ST9-IVb型的結果高度一致性。但這些菌株的spa分型結果卻各有不同,推測可能是豬源MRSA在四川地區(qū)新的傳播亞型。本研究中,spa分型以t1376為主,該類型菌株在數(shù)據(jù)庫(https://www.spaserver.ridom.de/spa-t1376.shtml)中主要以芬蘭和荷蘭流行為主。中國于2017年首次提交的t1376型別是甲氧西林敏感菌株(Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA)。本研究中,t1376以MRSA形態(tài)出現(xiàn),說明MSSA-t1376得到了進一步的進化與演變。ST59克隆型是中國地區(qū)CA-MRSA的主要流行類型。對于ST59 菌株,已發(fā)現(xiàn)至少兩種不同的SCCmec類型(IV和V)[46]。本研究也發(fā)現(xiàn)CA-MRSA ST59-IV隨著豬肉食品鏈或牲畜相關渠道在進一步傳播。成都市生鮮豬肉中分離的MRSA以CA-MRSA和LA-MRSA為主,說明豬肉源MRSA的傳播可能存在人與動物之間交叉污染。屠宰及銷售環(huán)境存在著一定的風險,相關部門應予以重視和加強防范。

金黃色葡萄球菌腸毒素種類具有多樣性,迄今發(fā)現(xiàn)的葡萄球菌腸毒素血清型有23種[47]。在MRSA腸毒素基因的檢測中,有13種腸毒素基因出現(xiàn)了陽性條帶,包括sea、seb、seg、sei、sem、sel、seu、sen、seo、seu、sek、seq和selx。58.33%菌株攜帶三種及以上腸毒素基因。成都市豬源MRSA對腸毒素攜帶情況不如陜西省豬源MRSA的攜帶情況嚴重[45],但MRSA8及MRSA13菌株攜帶了完整的egc基因簇,是食品安全潛在的危險因素,應當引起重視。

細菌生物被膜的形成給細菌提供了一個穩(wěn)定的生存環(huán)境,從而使其具有更強的抵抗能力,并難以消除[48]。國內(nèi)外一些相關報道認為,生物被膜陽性菌株的耐藥情況相較生物被膜陰性菌株更為嚴重[49]。本研究中24株MRSA均攜帶了生物被膜形成相關基因,其中,clfB、eno、icaBC和sasG的檢出率均為100%。62.50%的MRSA菌株同時攜帶耐消毒劑基因和耐藥基因,91.67%的菌株表現(xiàn)出多重耐藥性。桂中玉等[50]對127株能形成生物被膜的金黃色葡萄球菌(其中MRSA為107株)進行研究,發(fā)現(xiàn)菌株耐藥率高達90%,本實驗的研究結果與之相近。但未來針對MRSA菌株生物被膜形成與菌株攜帶耐消毒劑基因和耐藥基因之間是否有聯(lián)系還有待深入研究。

綜上,本文揭示了成都市豬肉源MRSA菌株的主要流行特征,MRSA菌株在生鮮豬肉中的傳播可能會導致嚴重的動物源食品安全問題,相關部門加強監(jiān)測和制定相應的防控策略十分必要。