王景尚 尹曉丹 何軍琴 武 穎 張 瑩 李憲銳

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100026)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是青春期和育齡期婦女最常見的一種復(fù)雜的內(nèi)分泌紊亂綜合征，是導(dǎo)致女性不孕癥發(fā)生的主要病因之一[1]。我國PCOS患者人群龐大，據(jù)統(tǒng)計在育齡期女性中的發(fā)病率高達(dá)5%～10%[2]。PCOS不僅影響女性的生殖功能，而且會使患者2型糖尿病、代謝綜合征及心腦血管疾病等遠(yuǎn)期并發(fā)癥的發(fā)病風(fēng)險顯著高于一般人群,并可持續(xù)到絕經(jīng)后，其機(jī)制被認(rèn)為與PCOS患者的胰島素抵抗(insulin resistance, IR)狀態(tài)有關(guān)[3-4]。臨床流行病學(xué)研究[5]顯示，PCOS患者伴有IR(polycystic ovary syndrome with insulin resistanc，PCOS-IR)的比例高達(dá)50%～70%，同時具有高發(fā)性、異質(zhì)性、終身性、難治性等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響女性身心健康，成為臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。建立可靠、簡便、符合臨床特征的PCOS-IR動物模型對于推動該病的深入研究具有重要意義。本課題組前期通過高糖高脂飲食喂養(yǎng)的方法成功構(gòu)建了IR及糖代謝異常大鼠模型，并經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證[6]。本研究在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用高糖高脂飲食和來曲唑灌胃的方法誘導(dǎo)構(gòu)建PCOS-IR大鼠模型，分析其內(nèi)分泌、胰島素抵抗和卵巢病理改變特征，旨在建立一種有效的、更加符合人體生理病理特征的PCOS-IR動物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6周齡SPF級雌性SD大鼠20只，體質(zhì)量160～180 g，購自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(京)2016-0010。飼養(yǎng)條件為2級，室溫保持在(22±2)℃，相對濕度(55±5)%，光照時間7:00～19:00。

1.2 動物飼料、藥物及試劑

動物飼料購自購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，其中高脂飼料含豬油20%、蔗糖10%、膽固醇1.25%、膽酸鹽0.25%，普通飼料68.5%；來曲唑購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；羅氏活力型血糖儀試紙購自德國羅氏診斷有限公司；血清促卵泡生成素(follicle stimulating hormone, FSH;批號：CSB-E06869r)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH;批號：CSB- E12654r)、睪酮(testosteron，T;批號：CSB-E05100r)及空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS;批號：CSB-E05070r)、ELISA試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 模型構(gòu)建

大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)數(shù)字表法選取10只作為對照組，其余10只作為模型組。對照組給予普通飼料，模型組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)28 d。于喂養(yǎng)第8天，模型組大鼠開始每日用0.4 mL溶于1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))羧甲基纖維素溶液(carboxymethyl cellulose solution，CMC)的來曲唑液(1 mg·kg-1·d-1)灌胃，對照組灌服0.4 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CMC溶液。自灌胃第7天開始每天早晨行陰道涂片，觀察陰道脫落細(xì)胞的周期變化，判斷動情周期。連續(xù)觀察至第21天，模型組大鼠均喪失完整動情周期，對照組大鼠均處于動情前期時，結(jié)束灌胃，以觀察基礎(chǔ)卵泡及性激素變化。灌胃結(jié)束后，各組大鼠在取材前一晚20：00開始禁食水，次日用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水合氯醛麻醉，尾靜脈采血，用羅氏血糖儀測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)濃度并記錄。隨后經(jīng)腹主動脈取血，收集血清標(biāo)本置-80 ℃保存?zhèn)溆?。迅速摘取雙側(cè)卵巢，放入4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛液固定。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 大鼠一般情況及陰道細(xì)胞學(xué)檢測

每日觀察大鼠活動、飲食、大小便及毛色等情況，每周稱體質(zhì)量1次；自實(shí)驗(yàn)開始第15 d起，每天早晨行陰道涂片，觀察陰道脫落細(xì)胞的周期變化，判斷動情周期，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4.2 大鼠血清性激素測定

取大鼠血清，采用ELISA法測定大鼠FSH、LH及T濃度，具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4.3 大鼠血糖、胰島素濃度測定與評估

用羅氏血糖儀測定FBG濃度,ELISA法測定FINS濃度。采用胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index，HOMA-IR)及胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index,ISI)評估IR程度。HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5。ISI=1/ FINS (mU/L)×FBG(mmol/L)[7]。

1.4.4 大鼠卵巢組織學(xué)形態(tài)觀察

應(yīng)用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法觀察大鼠卵巢組織形態(tài)。取出經(jīng)4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定的卵巢組織，常規(guī)組織脫水，石蠟包埋；將卵巢組織切成5 μm厚切片，常規(guī)脫蠟、水化后經(jīng)HE染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察兩組大鼠卵巢組織病理學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及體質(zhì)量的變化情況

2組大鼠飲食、活動、大小便及毛色均未見明顯異常，實(shí)驗(yàn)期間2組未見大鼠死亡。造模前2組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，造模后2組大鼠體質(zhì)量均較造模前顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，造模后模型組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),詳見表1。

2.2 大鼠動情周期觀察

正常雌性大鼠性成熟后，隨激素變化會產(chǎn)生4～5 d 規(guī)律的動情周期。本研究結(jié)果顯示，造模前大鼠動情周期穩(wěn)定，光學(xué)顯微鏡下陰道涂片觀察可見成熟的角化脫落上皮，到動情前期出現(xiàn)有核上皮細(xì)胞，出現(xiàn)規(guī)律動情周期，典型變化詳見圖1； 造模后10只大鼠的陰道角化和有核上皮數(shù)量均明顯減少，以角化上皮減少為主，動情期間和動情期后白細(xì)胞增加，角化上皮脫落減少，動情期縮短，動情間期延長，提示模型大鼠均失去動情周期變化，典型變化詳見圖2。

圖1 對照組大鼠1～15 d陰道涂片典型變化情況

圖2 模型組大鼠1～15 d陰道涂片典型變化情況

2.3 大鼠血糖及胰島素抵抗變化情況

與對照組相比，模型組FBG、FINS及HOMA-IR指數(shù)升高(P<0.01),ISI濃度降低(P< 0.01),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表2。

表2 各組大鼠血糖及胰島素抵抗情況比較

2.4 大鼠血清性激素變化情況

與對照組相比，模型組FSH降低(P<0.01)，T、LH濃度及LH/FSH比值均明顯升高(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。提示模型組大鼠出現(xiàn)顯著的高雄激素狀態(tài)和激素分泌異常，詳見表3。

表3 各組大鼠血清性激素濃度比較

2.5 大鼠卵巢HE染色情況

對照組大鼠鏡下可見多個不同發(fā)育時期的卵泡和黃體，極少見囊性擴(kuò)張卵泡，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞層較厚，排列整齊，卵泡膜細(xì)胞8～9層；光鏡下，多囊卵巢綜合征的典型形態(tài)學(xué)特征為：各級發(fā)育卵泡數(shù)量減少、有囊性擴(kuò)張的卵泡、閉鎖卵泡、黃體組織比例減少、卵泡顆粒細(xì)胞層減少或消失、泡膜細(xì)胞增生。模型組10只大鼠卵巢均呈現(xiàn)出典型的多囊樣改變，可見囊狀擴(kuò)張卵泡，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞層減少至2～3層，排列疏松，卵泡膜細(xì)胞增生，詳見圖3。

圖3 2組大鼠卵巢組織HE染色(光鏡,100×)

3 討論

PCOS是女性最常見的內(nèi)分泌代謝異常性疾病，主要臨床特征為持續(xù)性無排卵、高雄激素和卵巢多囊樣改變。近年來研究[3,8]顯示，約50%～70%的 PCOS患者存在明顯IR，10%的PCOS患者伴有糖尿病，同時PCOS-IR患者遠(yuǎn)期出現(xiàn)2型糖尿病的風(fēng)險亦顯著升高，提示了IR在PCOS發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。IR作為 PCOS最重要的病理生理機(jī)制，是導(dǎo)致PCOS患者超重和肥胖的主要原因，同時超重和肥胖也加重了PCOS的內(nèi)分泌和代謝紊亂[9]。在臨床中，PCOS-IR患者較單純PCOS的病理機(jī)制更加復(fù)雜、治療難度也更大，明確其發(fā)病機(jī)制并進(jìn)行有效的治療仍是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，而構(gòu)建可靠、簡便、符合臨床特征的動物模型是進(jìn)行相關(guān)研究的前提。

目前存在多種成熟的制備PCOS動物模型的方法，比如：芳香化酶抑制劑造模法、胰島素聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素模法、孕激素聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素造模法、雄激素造模法，皮下注射丙酸睪丸酮聯(lián)合高脂飼料飲食，上述造模方法均能很好地模擬PCOS在卵巢組織形態(tài)學(xué)及性激素方面的變化[10]。在此基礎(chǔ)上，聯(lián)合其他手段使模型大鼠出現(xiàn)顯著的IR及其所致的代謝異常特征，是成功制備出PCOS-IR動物模型的關(guān)鍵。目前，有學(xué)者[11-12]對此進(jìn)行了有益的嘗試，主要的方法有：通過皮下注射脫氫表雄酮或者丙酸睪丸油劑聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)的方法構(gòu)建，模型大鼠盡管出現(xiàn)了典型的PCOS-IR病理及內(nèi)分泌特征，但外源性雄激素注射的方法，并不適用于進(jìn)行模型大鼠雄激素變化的研究；通過皮下注射胰島素(insulin,INS)和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,HCG)的方法[13]，盡管亦構(gòu)建了均有IR及PCOS 特征的模型，但是并不符合PCOS-IR臨床發(fā)病的過程，對于研究大鼠胰島素濃度變化不適用；通過來曲唑聯(lián)合高脂飼料飲食21～30 d的方法[14-16]，成功制備了基本符合PCOS-IR 病理及內(nèi)分泌、代謝紊亂疾病特征的模型，但也存在模型大鼠糖代謝異常及IR程度不高的缺點(diǎn)。

來曲唑作為一種芳香化酶抑制劑，目前被廣泛應(yīng)用于PCOS模型的制備，其主要機(jī)制是通過抑制芳香化酶的生物學(xué)作用，減少雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而降低雌激素濃度，消除其對下丘腦的負(fù)反饋抑制，從而使垂體促性腺激素分泌增加，高水平、失去脈沖的LH作用于卵泡膜細(xì)胞，生成過多的雄激素，體內(nèi)雄激素堆積，特別是卵巢局部雄激素增加，導(dǎo)致排卵障礙和卵巢多囊樣改變[17]。盡管來曲唑造模法建立起來的PCOS大鼠模型表現(xiàn)出和人類PCOS類似的代謝特征，但是存在IR狀態(tài)不夠典型的弊端。來曲唑聯(lián)合高脂飼料的方法，從一定程度上解決了這一弊端，但是模型大鼠的糖代謝異常和IR程度仍不夠明顯。本課題組長期從事胰島素抵抗和2型糖尿病的相關(guān)基礎(chǔ)研究，前期通過高糖高脂飼料喂養(yǎng)的方法成功構(gòu)建了具備顯著IR及糖代謝異常特征的大鼠模型，并經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證[5-6]。

本研究沿用前期使用的高糖高脂飼料配方和干預(yù)時間，聯(lián)合連續(xù)來曲唑灌胃的方法，嘗試構(gòu)建PCOS-IR大鼠模型。研究結(jié)果顯示，經(jīng)過28 d的高糖高脂飼料喂養(yǎng)和21 d的來曲唑灌胃后，模型大鼠體質(zhì)量明顯增加，INS濃度顯著升高，HOMA-IR指數(shù)提高3倍以上，同時伴有ISI的顯著下降，空腹FBG濃度亦顯著下降，從而提示模型大鼠出現(xiàn)了顯著的高胰島素血癥及糖代謝紊亂，表現(xiàn)出了顯著的IR特征。動情周期的典型變化為：動情前期，大量有核上皮細(xì)胞，偶有少量角化細(xì)胞；動情期，鱗片狀無棱角化細(xì)胞，或間自少量上皮細(xì)胞；動情后期，大量白細(xì)胞；動情間期，白細(xì)胞為主，有核細(xì)胞及無核角化細(xì)胞同時存在，以白細(xì)胞為主。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清T濃度出現(xiàn)顯著升高，同時大鼠出現(xiàn)持續(xù)的無排卵現(xiàn)象及卵巢組織多囊樣改變，提示模型組大鼠顯現(xiàn)了顯著的IR-高胰島素血癥-高雄激素狀態(tài)及典型的PCOS改變。高胰島素血癥可以刺激卵巢合成大量雄激素形成高雄激素血癥，尤其是游離雄激素濃度升高，引起IR的發(fā)生。兩者互相促進(jìn)并形成IR-高胰島素血癥-高雄激素血癥的惡性循環(huán)，共同參與卵巢功能障礙的發(fā)生，本研究結(jié)果與此一致。同時，模型組大鼠血清LH及LH/FSH比值顯著升高，符合典型的PCOS性激素特征。以上研究結(jié)果顯示，模型組大鼠體質(zhì)量顯著增加，出現(xiàn)持續(xù)無排卵現(xiàn)象，卵巢組織呈多囊樣改變，同時血清T、LH、LH/FSH比值均顯著升高，此外血清INS和HOMA-IR值顯著升高、IRI指數(shù)顯著降低，符合人類PCOS-IR的典型病理改變。

綜上所述，高糖高脂飼料聯(lián)合來曲唑連續(xù)灌胃的方法可以成功構(gòu)建具有顯著PCOS-IR病理形態(tài)、內(nèi)分泌異常、代謝紊亂特征的大鼠模型，為未來進(jìn)行相關(guān)后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。