李 志 張 郡 戴悅萱 秦明陽 梁芙茹

(1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)包頭臨床醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010000； 2. 包頭市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014040； 3.鞍山市長大醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧鞍山 114000；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100730； 5. 內(nèi)蒙古呼倫貝爾第二人民醫(yī)院內(nèi)二科， 內(nèi)蒙古扎蘭屯 162650)

隨著糖尿病患病率的逐年遞增，糖尿病所導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙日益受到廣泛重視。流行病學(xué)研究[1]已證實，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)之間存在病理生理聯(lián)系。國際糖尿病聯(lián)盟2007年發(fā)布的《餐后血糖管理指南》[2]中曾明確指出波動性高血糖產(chǎn)生的危害遠(yuǎn)高于慢性持續(xù)性高血糖，且血糖波動幅度越大，慢性并發(fā)癥的發(fā)病率越高，預(yù)后也越差。臨床研究[3]顯示，T2DM患者的認(rèn)知功能與急性血糖波動有明顯的相關(guān)性。糖尿病患者日常生活中不可避免地存在異常的血糖波動，研究波動性高血糖影響認(rèn)知功能的可能機制，探索新的治療靶點，對預(yù)防和治療糖尿病認(rèn)知功能障礙具有重大的意義。

氧化應(yīng)激損傷是機體或細(xì)胞內(nèi)以氧自由基為代表的氧化性物質(zhì)產(chǎn)生與消除的一種失平衡狀態(tài)。臨床試驗[4]顯示：與持續(xù)高血糖相比,糖尿病患者血糖波動更顯著增加氧化應(yīng)激產(chǎn)物的生成，提示異常的血糖波動與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。關(guān)于血糖波動與氧化應(yīng)激損傷的研究不多，主要集中于體外細(xì)胞培養(yǎng)：與持續(xù)高血糖環(huán)境相比，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)在血糖波動環(huán)境中時，線粒體產(chǎn)生更多的活性氧簇[5]，細(xì)胞外環(huán)境中的葡萄糖濃度上下波動比持續(xù)高糖濃度對細(xì)胞的危害更大，導(dǎo)致氧化應(yīng)激產(chǎn)物過度生成，繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡增加[6]。但糖尿病患者血糖波動所致的認(rèn)知功能下降是否與體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷相關(guān)，其具體機制尚未在動物模型體內(nèi)實驗中驗證。由此本課題組建立了糖尿病血糖波動模型，觀察認(rèn)知功能改變情況，并檢測其海馬氧化應(yīng)激指標(biāo)——丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活性，研究血糖波動是否導(dǎo)致認(rèn)知下降，是否與氧化應(yīng)激相關(guān)聯(lián)，為糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的防治提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

36只Wistar大鼠：健康、雄性，體質(zhì)量90～130 g，4～6周，由內(nèi)蒙古大學(xué)動物中心提供[實驗動物使用許可證號：SCXK(蒙)2016-0001]。

1.2 2型糖尿病大鼠模型的制備

在溫度為22 ℃±2 ℃，相對濕度為50%～60%的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。將36只大鼠采用簡單隨機化分組法分為對照組(C組，n=10)及2型糖尿病組(T2DM組，n=26)。C組以維持飼料喂養(yǎng)，T2DM組以高糖高脂飼料喂養(yǎng)(豬油12%，糖10%，奶粉6%，雞蛋5%，油炸花生5%，鹽1%和麻油1%)。T2DM組高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后，過夜禁食不禁水15 h，用現(xiàn)配的檸檬酸緩沖液溶解鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)粉末，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的STZ溶液，按30 mg/kg的劑量通過腹腔注射誘導(dǎo)2型糖尿病。1周后，禁食不禁水16 h，隨機測定兩次非同日空腹血糖，血糖濃度≥16.7 mmol/L的24只大鼠視為糖尿病模型成功[7]，成功率為92.3%。

1.3 建立反復(fù)餐后血糖波動的糖尿病大鼠模型

選取造模成功的糖尿病大鼠24只，采用簡單隨機化分組法分為持續(xù)高糖組(sustained hyperglycemia group，SHG，n=12)和血糖波動組(intermittent hyperglycemia group，IG，n=12)。將所有大鼠均建立12 h的反向光/暗周期(暗：7:00～19:00;光：19:00～7:00)，并對C組繼續(xù)以維持飼料不計時不計量喂養(yǎng)，SHG組繼續(xù)以高糖高脂飼料不計時不計量喂養(yǎng)，對IG組大鼠的進食時間進行限制，每個時間段1 h，每天兩個時間段(分別為9:00～10:00和15:00～16:00[8])，造成人為的餐后血糖波動模式。

1.4 指標(biāo)觀察及檢測方法

1.4.1 各組大鼠日內(nèi)9次血糖濃度及量化血糖穩(wěn)定性指標(biāo)檢測

血糖波動成模6周后，每周1次，測1 d內(nèi)8時～12時、15時～18時中9個整點的血糖值，并繪制血糖變化趨勢曲線。用日內(nèi)血糖波動評估參數(shù)——血糖日平均水平(mean blood glucose，MBG)、日平均血糖的標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation of daily average blood glucose, SDBG)、最大血糖波動幅度(largest amplitude of glycemic excursions, LAGE)量化各組大鼠血糖穩(wěn)定性，并采用廣大學(xué)者公認(rèn)的血糖波動金標(biāo)準(zhǔn)——平均血糖波動幅度(mean amplitude of glycemic excursion, MAGE)作為重要的血糖波動衡量參數(shù)，因其并非某個時間點或某個時間段的血糖數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)離散特征，而是反映一天整個觀察時段的血糖波動情況。根據(jù)MAGE的原始定義，通過比較篩選數(shù)據(jù)的人工計算方法進行參數(shù)值計算。具體計算方法如下：

(1)繪制血糖數(shù)據(jù)曲線。利用EXCEL將日內(nèi)所有血糖數(shù)據(jù)點繪制成血糖曲線，便于后續(xù)觀察篩選血糖波動數(shù)據(jù)點。

(2)計算日內(nèi)所有血糖數(shù)據(jù)點的標(biāo)準(zhǔn)差(SDBG)，作為血糖數(shù)據(jù)篩選的參考值。

(3)在血糖數(shù)據(jù)曲線圖中，標(biāo)記出所有的峰谷血糖值點(即極值點)。

(4)從始到末，觀察并記錄連續(xù)兩個相鄰極值點的差是否均大于1個SDBG，若是則記錄為一個有效血糖波動，重復(fù)此步驟，直到觀察完所有的極值點。

(5)統(tǒng)計(4)中有效血糖波動的個數(shù)，根據(jù)第一個有效波動的方向(從波谷到波峰或從波峰到波谷)計算MAGE。計算公式如下：

式中，AGEi(i=1…n)(amplitude of glycemic excursions, AGE)表示根據(jù)第一個有效波動的方向(從波谷到波峰或從波峰到波谷)的所有有效血糖波動的波動幅度，n表示有效血糖波動個數(shù)[9]。

1.4.2 Morris 水迷宮實驗

血糖波動第10周進行Morris水迷宮實驗，每只動物每天訓(xùn)練4次，共訓(xùn)練4 d。將各組大鼠分別于相同時間段放入水中，測定大鼠對水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的能力，并用攝像頭記錄結(jié)果。(1)定位航行試驗：前4天，每天將大鼠面向池壁依次從4個象限的中點放入水中，并記錄其120 s內(nèi)尋找到隱藏在水面下平臺的時間——逃避潛伏期(escape latency)，且每次訓(xùn)練間隔60 s以上，記錄并比較各組第4天的逃避潛伏期。(2)空間探索實驗(spatial probe test)：第5天任選1個入水點(本實驗采用平臺對面的象限中點為入水點)，將大鼠放入水池中，并記錄大鼠在120 s內(nèi)的游泳軌跡，考察大鼠對原平臺的記憶能力。

1.4.3 海馬區(qū)氧化應(yīng)激指標(biāo) MDA、SOD、GSH-Px的測定

于血糖波動成模后第11周，從各組中隨機選取6只，斷頭法處死大鼠，取海馬組織，并用鑷子在冰冷的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(以下簡稱生理鹽水)中漂洗，除去血液，濾紙擦干，稱其質(zhì)量。取雙側(cè)海馬組織按質(zhì)量體積比1∶9加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)[0.86%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯化鈉注射液]，用超聲波細(xì)胞粉碎機破碎組織，將制備好的10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的勻漿用4 ℃低溫離心機3 000 r/min離心12 min，用移液器吸出上清液，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，測定各組上清液中MDA、SOD、GSH-Px濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血糖波動6周后各組大鼠日內(nèi)血糖變化及血糖波動參數(shù)

與對照組相比，T2DM組(IG組和SHG組)血糖明顯增高，且IG組比SHG組血糖波動范圍大，IG組SDBG、LAGE、MAGE高于SHG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，MBG低于SHG組,詳見表1。其中，IG組血糖值在10:00和11:00較高，然后呈現(xiàn)出下降趨勢至15:00，之后血糖持續(xù)上升至17:00左右達(dá)到高峰(圖1)。

表1 血糖波動6周后各組大鼠MBG、SDBG、LAGE、MAGE比較

圖1 血糖波動 6 周后各組大鼠日內(nèi)血糖變化趨勢圖

2.2 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力情況

血糖波動第10周時，通過Morris水迷宮實驗檢測發(fā)現(xiàn)，T2DM組大鼠第4天的潛伏期長于對照組(P<0.05)。與SHG組相比，IG組第4天的潛伏期呈現(xiàn)延長的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),詳見表2。與C組相比，T2DM組大鼠第5天的穿越平臺次數(shù)、經(jīng)過目標(biāo)象限(定位航行實驗中平臺所在象限)的活動路程比(經(jīng)過目標(biāo)象限路程與運動總路程的比值)和活動時間比(經(jīng)過目標(biāo)象限時間與運動總時間的比值)均減少(P<0.05)。IG組與SHG組相比，第5天穿越平臺次數(shù)、經(jīng)過目標(biāo)象限的活動路程比與活動時間比均進一步降低(P<0.05)。C組大鼠與T2DM大鼠上臺前游動距離和平均速度之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3。

表2 Morris 水迷宮測試大鼠逃避潛伏期

表3 Morris水迷宮實驗大鼠空間探索數(shù)據(jù)

2.3 各組大鼠海馬組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定

與C組相比，T2DM大鼠MDA升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px降低(P<0.05)。與SHG組相比，IG組大鼠MDA升高(P<0.05)，SOD及GSH-Px降低(P<0.05)(表4)。

表4 大鼠海馬組織內(nèi)MDA、SOD及GSH-Px測定

2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)與學(xué)習(xí)記憶能力的相關(guān)性

采用Pearson相關(guān)分析分別評價MDA、GSH-Px、SOD與3組大鼠(n=18)活動路程比、活動時間比的關(guān)系，結(jié)果顯示：MDA與大鼠活動路程比、活動時間比呈負(fù)相關(guān)；GSH-Px、SOD與大鼠活動路程比、活動時間比呈正相關(guān)。采用Spearman相關(guān)分析分別評價MDA、GSH-Px、SOD與大鼠穿越平臺次數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示MDA與大鼠穿越平臺次數(shù)呈負(fù)相關(guān)；GSH-Px、SOD與大鼠穿越平臺次數(shù)呈正相關(guān)，詳見表5。

表5 氧化應(yīng)激指標(biāo)與大鼠活動路程比、活動時間比及穿越平臺次數(shù)的相關(guān)性

3 討論

文獻[10]報道，制備糖尿病大鼠模型的方法有單純腹腔注射大劑量的STZ(50～70 mg/kg)和高糖高脂飲食(4～8周)聯(lián)合小劑量STZ(30～50 mg/kg)兩種。后一種方法制備的動物模型類似2型糖尿病特點，如高糖高脂飲食會誘導(dǎo)胰島素抵抗，同時低劑量的STZ誘導(dǎo)胰島素分泌輕度損傷，這是T2DM后期的特征[11]。研究[12]顯示,高糖高脂飼料誘導(dǎo)時間過短或者STZ劑量過小都不容易誘導(dǎo)糖尿病模型的建立，而且STZ誘導(dǎo)成功后如果停止高糖高脂飼料的喂養(yǎng)，空腹血糖會在一周內(nèi)又恢復(fù)到正常濃度。本試驗選擇高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合單次注射STZ(30 mg/kg)造成血糖相對較低的2型糖尿病模型，以注射后7 d后，測非同日2次隨機血糖濃度≥16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠模型成功的標(biāo)準(zhǔn)[7]，成模率為92.3%。

關(guān)于血糖波動模型的建立，有文獻[13]報道通過給予T2DM組大鼠皮下注射胰島素，人為造成血糖波動狀態(tài)。但有研究[14]報道經(jīng)鼻胰島素的短期治療可以改善早期阿爾茨海默病特征性的病理沉積，從而改善認(rèn)知功能，如若采用外源性胰島素來制造血糖波動模型，很可能人為影響大鼠的認(rèn)知功能，無法對大鼠認(rèn)知改變情況進行客觀評判。國外有報道[8]通過改變大鼠日常飲食習(xí)慣和生物節(jié)律的方式來模擬糖尿病患者隨進食而產(chǎn)生的血糖波動狀態(tài)，由此本實驗采用該方法造成血糖波動狀態(tài)，避免了外源性胰島素對T2DM大鼠認(rèn)知水平可能造成的影響，從而能夠客觀體現(xiàn)血糖波動對T2DM大鼠認(rèn)知功能的影響。在諸多血糖波動的評估參數(shù)中，MBG、SDBG、LAGE能夠比較直觀地反映血糖波動性，是主要體現(xiàn)血糖離散特征的衡量指標(biāo)。而富有代表性的MAGE最早于2006年提出，它反映的血糖波動狀況具有其獨特優(yōu)勢，是反映日內(nèi)血糖波動的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本實驗通過檢測日內(nèi)9個整點的血糖值，得到日內(nèi)MBG、SDBG、LAGE等量化指標(biāo)來評價血糖的穩(wěn)定性。實驗顯示，IG組大鼠SDBG、LAGE、MAGE高于SHG組，MBG低于SHG組。通過以上結(jié)果證實：改變大鼠日常飲食習(xí)慣和生物節(jié)律可以成功建立血糖波動模型，能夠有效地模擬臨床糖尿病患者的血糖波動狀況。

Morris水迷宮主要測試實驗動物對空間位置感和方向感(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力，用于檢測動物的認(rèn)知功能。本研究通過Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)，與C組相比，T2DM大鼠第4天逃避潛伏期延長，第5天穿越平臺次數(shù)、經(jīng)過目標(biāo)象限活動路程比和活動時間比減少，提示T2DM組大鼠存在學(xué)習(xí)記憶障礙。最近研究[15]顯示，T2DM可以累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進而導(dǎo)致認(rèn)知功能損害，其機制可能與氧化應(yīng)激、胰島素抵抗、腦血管病變、糖、能量代謝受損以及突觸的可塑性有關(guān)[16]。而且本研究顯示，IG組與SHG組相比，上述檢測指標(biāo)均有顯著變化，表明血糖波動更易導(dǎo)致T2DM大鼠認(rèn)知功能受損。為闡明具體機制，筆者進而檢測了大鼠海馬組織的氧化應(yīng)激指標(biāo)。正常情況下，機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)和氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡，而氧化應(yīng)激損傷是細(xì)胞或機體內(nèi)氧化性物質(zhì)產(chǎn)生與消除失衡的一種狀態(tài)。常用的檢測指標(biāo)MDA不但是膜脂過氧化反應(yīng)的總產(chǎn)物，而且是反映機體氧化損傷的指標(biāo)。SOD和GSH-Px是主要的抗氧化酶，其中SOD是評價機體的抗氧化能力的經(jīng)典指標(biāo)，GSH-Px的作用是保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整。本實驗顯示：T2DM大鼠較正常對照組海馬組織MDA升高，而SOD、GSH-Px明顯下降，同時血糖波動組比持續(xù)高糖組變化更明顯。T2DM是AD公認(rèn)的危險因素之一，T2DM的外周胰島素抵抗與AD患者腦內(nèi)的胰島素抵抗非常相似，而且研究[17]顯示，T2DM與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。本實驗驗證了T2DM與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，并且提示血糖波動比持續(xù)高血糖更易誘發(fā)氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為氧化應(yīng)激損傷更明顯、抗氧化能力也隨之降低。而且最近也有類似報道[18]，經(jīng)靜脈短時間(48 h)灌注葡萄糖的大鼠，波動性高糖灌注組比持續(xù)高糖灌注組的血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生更多的氧化應(yīng)激產(chǎn)物。

本研究通過相關(guān)與回歸分析發(fā)現(xiàn)：大鼠海馬組織氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH-Px和SOD與大鼠活動路程比、活動時間比及穿越平臺次數(shù)明顯相關(guān)。MDA與大鼠的活動路程比、活動時間比及穿越平臺次數(shù)均呈負(fù)相關(guān)，即大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力隨著MDA的增加而降低；而抗氧化酶GSH-Px、SOD與大鼠的活動路程比、活動時間比及穿越平臺次數(shù)均呈正相關(guān)，即隨著GSH-Px、SOD的增加，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力表現(xiàn)越好。進一步說明了T2DM引發(fā)的認(rèn)知功能受損很可能與海馬組織氧化應(yīng)激失衡密切相關(guān)。

上述研究結(jié)果表明，在高糖高脂飲食聯(lián)合腹腔注射小劑量的STZ(30 mg/kg)基礎(chǔ)上，通過改變大鼠飲食習(xí)慣及生物節(jié)律可以建立血糖波動模型；血糖波動比持續(xù)高血糖更易影響T2DM大鼠的認(rèn)知功能；血糖波動會加劇海馬區(qū)氧化應(yīng)激損傷，氧化應(yīng)激損傷很可能是引起T2DM認(rèn)知功能受損的重要發(fā)病機制之一。