汪永松 耿濤 盧芙萍 武華周 婁德釗 涂娜娜 王樹(shù)昌

摘? 要：球孢白僵菌（Beauveria bassiana）在宿主昆蟲(chóng)體壁穿透和體內(nèi)定植過(guò)程中分泌了Bbchitinase 1和Bbchitinase 2兩種胞外幾丁質(zhì)酶，但二者的作用分工尚不明確。本文通過(guò)菌株胞外總幾丁質(zhì)酶活性與侵染毒力的相關(guān)性分析，Bbchitinase 1和Bbchitinase 2基因表達(dá)水平與侵染毒力的相關(guān)性分析，Bbchitinase 1和Bbchitinase 2的生物信息學(xué)分析以及在侵染過(guò)程中的表達(dá)模式分析，以期明晰Bbchitinase 1和Bbchitinase 2在菌株侵染宿主過(guò)程中的作用分工。結(jié)果表明，菌株胞外幾丁質(zhì)酶活性與侵染毒力呈正相關(guān)，但Bbchitinase 1和Bbchitinase 2表達(dá)水平不同。菌株間Bbchitinase 1表達(dá)水平與菌株侵染毒力（MMT和LT50）呈顯著正相關(guān)，而B(niǎo)bchitinase 2表達(dá)水平卻與侵染毒力不相關(guān)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，Bbchitinase 1和Bbchitinase 2具有顯著的結(jié)構(gòu)和功能差異，可能結(jié)合不同的配體蛋白，參與不同的代謝過(guò)程。表達(dá)模式分析結(jié)果表明，Bbchitinase 1和Bbchitinase 2基因在侵染宿主過(guò)程中均上調(diào)表達(dá);但Bbchitinase 1僅在侵染家蠶的體壁穿透階段顯著上調(diào)表達(dá)，而B(niǎo)bchitinase 2在芽生孢子生成階段和菌絲大量增殖階段顯著上調(diào)表達(dá)。以上研究結(jié)果說(shuō)明，Bbchitinase 1可能參與菌株侵染早期的侵入釘形成和體壁穿透過(guò)程，與侵染毒力呈正相關(guān);而B(niǎo)bchitinase 2可能參與侵染過(guò)程中的芽生孢子發(fā)育和菌絲大量增殖代謝調(diào)控。本研究明晰了球孢白僵菌不同幾丁質(zhì)酶在侵染過(guò)程中的作用分工，建立了以Bbchitinase 1基因表達(dá)水平判定菌株毒力的數(shù)學(xué)模型，為高毒、高穩(wěn)定性球孢白僵菌生防菌株的篩選提供重要科學(xué)依據(jù)，對(duì)提升綠色生態(tài)防治應(yīng)用效果具有重要意義。

關(guān)鍵詞：球孢白僵菌;毒力因子;幾丁質(zhì)酶;家蠶

中圖分類(lèi)號(hào)：S476.12? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Different Roles of Beauveria bassiana Bbchitinase 1 and Bbchitinase 2 in Host Infection

WANG Yongsong1， GENG Tao2， LU Fuping2， WU Huazhou2， LOU Dezhao1， TU Nana1， WANG Shuchang2*

1. Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Two extracellular chitinases were secreted by Beauveria bassiana during the infection process， named as Bbchitinase 1 and Bbchitinase 2， but the roles were not clear yet. The correlation analysis between chitinase activity and virulence， correlation analysis between gene expression level and virulence， bioinformatics analysis and expression patterns assay were performed in this paper in order to clarify different roles of Bbchitinase 1 and Bbchitinase 2. Statistical analysis and inhibition test showed that extracellular chitinase activitiy was positively correlated with the virulence， while the expression levels of Bbchitinase 1 and Bbchitinase 2 were different in strains. The expression level of Bbchitinase 1 was positively correlated with the virulence of the strains （MMT and LT50）; meanwhile， there was no significant relationship between Bbchitinase 1 and virulence of the strains. In addition， the bioinformatics analysis showed that there were significant differences in structure and function of Bbchitinase 1 and Bbchitinase 2， which might combine with different ligands and participate in different metabolic processes. Furthermore， the spatiotemporal expression pattern analysis showed that Bbchitinase 1 was significantly up-regulated only in the formation of penetration peg and penetration of perisoma stage of infection， meanwhile Bbchitinase 2 was slightly up-regulated in the formation of blastospore stage and significantly up-regulated in the mycelial vegetative growth stage. The results suggested that Bbchitinase 1 might be involved into body wall penetration at early infection stage and had positive correlation with virulence， while Bbchitinase 2 into the proliferation and metabolism of mycelium at the later infection stage. The results of this study clarified the role of different chitinases in the infection process of B. bassiana， and established a mathematical model to determine the virulence of B. bassiana based on the expression level of Bbchitinase 1 gene， which provides the important scientific basis for screening of high toxicity and high stability biocontrol strains and great significance for improving the application effect of green ecological control.

Keywords： Beauveria bassiana; virulence factor; chitinase; Bombyx mori

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.027

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是研究最早、應(yīng)用最廣的生防病原微生物[1-2]。具有安全性高、兼容性好、適應(yīng)性強(qiáng)、寄生性廣、孢子易培養(yǎng)、專(zhuān)性寄生可塑性強(qiáng)等特點(diǎn)，是最好的生防應(yīng)用真菌[3]。然而球孢白僵菌具有侵染毒力穩(wěn)定性差，菌株退化嚴(yán)重，防治速度慢，應(yīng)用成本高等缺點(diǎn)。需要深入研究和明確毒力因子的作用機(jī)制，并作為菌株毒力的量化指標(biāo)。

病原真菌侵染宿主昆蟲(chóng)是侵入釘機(jī)械壓力和胞外水解酶系共同作用的結(jié)果[4-5]。菌株在孢子附著與萌發(fā)、侵入釘發(fā)育和體內(nèi)定植等侵染過(guò)程中合成分泌了幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、酯酶、淀粉酶、脂肪酶等水解酶類(lèi)[6]。幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)體壁前表皮和后表皮的主要成分，構(gòu)成了體壁的剛性結(jié)構(gòu)和防御功能，因此病原真菌的幾丁質(zhì)酶活性成為侵染毒力的首要關(guān)鍵毒力因子[7]。

目前已經(jīng)從常用生防真菌如球孢白僵菌中鑒定出2個(gè)幾丁質(zhì)酶基因（Bbchitinase 1和Bbchitinase 2），金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）中鑒定出5個(gè)幾丁質(zhì)酶基因（Machit 1、2、3、4、5），黃綠綠僵菌（Metarhizium flavoviride）中鑒定出2個(gè)幾丁質(zhì)酶基因（Mfchit 1和Mfchit 2）[8-10]。生物信息學(xué)分析和功能研究表明，不同菌株的胞外幾丁質(zhì)酶基因氨基酸序列和功能差異顯著，參與侵入宿主、形態(tài)建成、營(yíng)養(yǎng)發(fā)育、自溶增殖等生命過(guò)程[11-12]。球孢白僵菌Bbchitinase 1和Bbchitinase 2在侵染家蠶幼蟲(chóng)的過(guò)程中均上調(diào)表達(dá)[4]。郝蕾蕾等[13]過(guò)表達(dá)Bbchitinase 1顯著提高了白僵菌對(duì)桃蚜的毒力，而Ramanujam等[14]過(guò)表達(dá)Machit 1卻未能提高金龜子綠僵菌對(duì)煙草天蛾（Manduca sexta）的毒力。因此不同真菌的Chitinase 1的具體功能尚未統(tǒng)一，而B(niǎo)bchitinase 2的具體功能亦不明確。

本研究擬通過(guò)胞外幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定、幾丁質(zhì)酶抑制劑試驗(yàn)、基因表達(dá)水平分析、侵染毒力相關(guān)性分析、生物信息學(xué)分析以及侵染家蠶過(guò)程中時(shí)空表達(dá)模式分析等試驗(yàn)，研究分析球孢白僵菌Bbchitinase 1和Bbchitinase 2在菌株侵染宿主過(guò)程中可能的作用分工，對(duì)球孢白僵菌侵染毒力量化指標(biāo)的確定和高毒菌株的分子改造具有重要科學(xué)意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

球孢白僵菌Bbcaasipp-Hv菌株、Bbcaasipp-Lv菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所吳圣勇副研究員惠贈(zèng);球孢白僵菌HN6、BbMQ-04、B8、BbMQ-09菌株保存于江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所家蠶生理病理研究室;家蠶（Bombyx mori）p50（大造），由江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所提供。

1.2? 方法

1.2.1? 單孢子懸液制備? 取球孢白僵菌菌株原種，接種于蟲(chóng)尸粉PDA平板上，（27±1）℃，培養(yǎng)10 d;刮下孢子，加入適量0.15 mol/L NaCl溶液，充分吹打;將孢子和菌絲的混合液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，滴加1滴吐溫80，漩渦震蕩10 min，使孢子分散，用滅菌棉球過(guò)濾，即得到單孢子懸液;用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，稀釋至終濃度為1×108個(gè)/mL。

1.2.2? 不同菌株侵染毒力測(cè)定? 取5齡起家蠶幼蟲(chóng)，浸于單孢子懸液中浸泡5 s，進(jìn)行接種，以浸入無(wú)菌水為對(duì)照;每組50頭幼蟲(chóng)，每組2次重復(fù);每隔6 h記錄發(fā)病數(shù)和死亡數(shù);用Finney概率分析法和SSPS 20.0軟件比較分析家蠶半數(shù)發(fā)病時(shí)間（MMT）和半數(shù)死亡時(shí)間（LT50）及95%置信區(qū)間。

1.2.3? 不同菌株胞外幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定? 取球孢白僵菌單孢子懸液，按1%（V/V）比例接種到蟲(chóng)尸粉PDA液態(tài)培養(yǎng)基中，（27±1）℃，120 r/min，培養(yǎng)4 d;真空泵抽濾，5000 r/min離心，上清液即為粗酶液;按照耿濤[4]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定酶活性。用KMO test和Bartlett test分析酶活性與侵染毒力的相關(guān)性。

1.2.4? 幾丁質(zhì)酶抑制劑處理? 分別取200 μL球孢白僵菌單孢子懸液，于2個(gè)1.5 mL無(wú)菌EP管中，分別加入200 μL H2O（對(duì)照組）、200 μL 10 μmol/L幾丁質(zhì)酶抑制劑Allosamidin（實(shí)驗(yàn)組），充分混合均勻，制成工作孢子懸液;取5 μL工作孢子懸液，涂布于5齡起蠶體壁上，1皿1頭蠶飼育;每組50頭幼蟲(chóng)，每組2次重復(fù);每隔8 h記錄家蠶幼蟲(chóng)的發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)，用SSPS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算MMT和LT50，用T-test檢測(cè)差異顯著性（P<0.05，以*標(biāo)記）。

1.2.5? 不同菌株Bbchitinase 1和Bbchitinase 2表達(dá)水平測(cè)定? 取球孢白僵菌菌株原種，接種于蟲(chóng)尸粉PDA平板上，（27±1）℃，培養(yǎng)8 d;刮下菌絲和孢子，液氮速凍，研磨充分;按照1.2.8提取和純化總RNA，完成cDNA的合成和qRT-PCR。用KMO test和Bartlett test分析基因表達(dá)水平與侵染毒力的相關(guān)性。

1.2.6? Bbchitinase 1和Bbchitinase 2生物信息學(xué)分析? 應(yīng)用鄰接法（neighbor joining）和MEGA 7.0軟件構(gòu)建Bbchitinase 1和Bbchitinase 2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù);用SMART和SWISS-MODEL在線分析軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)建立Bbchitinase 1和Bbchitinase 2蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)模型并分析其功能。

1.2.7? Bbchitinase 1和Bbchitinase 2侵染家蠶過(guò)程中表達(dá)模式分析? 取球孢白僵菌單孢子懸液，浸泡感染家蠶2齡幼蟲(chóng)，每隔6 h采集2齡蠶;5頭幼蟲(chóng)1管，為1個(gè)樣本，每個(gè)樣本2次重復(fù);液氮凍存。按照1.2.8提取和純化總RNA，完成cDNA的合成和qRT-PCR。

1.2.8? 樣本總RNA提取、純化、cDNA的合成和qRT-PCR? 按照RNA真菌提取試劑盒（OMEGA）說(shuō)明書(shū)完成菌株Total RNA的提取和純化。按照PrimeScript Kit（TaKaRa）說(shuō)明書(shū)合成cDNA。

登錄NCBI，依據(jù)Bbchitinase 1（GenBank登錄號(hào)：GU073382.1）、Bbchitinase 2（GenBank登錄號(hào)：AY147011.1）和Bbtubulin（GenBank登錄號(hào)：AJ312228）的CDS序列;應(yīng)用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物，序列為Bbchitinase 1：F5′-CCATTGTGCCGATTCTGA-3′，R5′-AGG TTGGTCTGCGAGGTG-3′;Bbchitinase 2：F5′-AGT CGCTGCTCTAAT-3′，R5′-TCTGTTGGCTGGA A-3′;Bbtubulin：F5′-TCACCTCCAGACCG-3′，R5′-CCACAACGAAATCAA-3′。

按照TaKaRa說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用ABI 7300 qRT-PCR儀完成qRT-PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，70 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。用2-△△CT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 球孢白僵菌胞外總幾丁質(zhì)酶活性與侵染毒力的相關(guān)性分析

各菌株的MMT和LT50見(jiàn)表1，侵染毒力強(qiáng)弱依次為Bbcaasipp-Hv>HN6>BbMQ04>B8>BbM Q09>Bbcaasipp-Lv。各菌株胞外總幾丁質(zhì)酶活性見(jiàn)表2，酶活性高低依次為Bbcaasipp-Hv>HN6> BbMQ09>Bbcaasipp-Lv>BbMQ04>B8。抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，抑制球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶活性則顯著降低其侵染毒力（圖1）。相關(guān)性分析表明，Bbcaasipp-Hv、HN6、BbMQ04、B8菌株侵染毒力與胞外幾丁質(zhì)酶活性呈顯著正相關(guān)，而B(niǎo)bMQ09和Bbcaasipp-Lv菌株為統(tǒng)計(jì)異質(zhì)因子（圖2），即酶活性相對(duì)較高，但是侵染毒力卻相對(duì)較低，說(shuō)明BbMQ09和Bbcaasipp-Lv菌株的胞外幾丁質(zhì)酶組成成分可能與其他菌株不同。

2.2? Bbchitinase 1和Bbchitinase 2表達(dá)水平與侵染毒力的相關(guān)性

針對(duì)2.1的結(jié)果，進(jìn)一步檢測(cè)了6個(gè)球孢白僵菌菌株的Bbchitinase 1和Bbchitinase 2的表達(dá)水平。如圖3所示，Bbchitinase 1在不同菌株間的表達(dá)水平差異顯著（均方=72.667，P<0.05），而B(niǎo)bchitinase 2在不同菌株間表達(dá)水平差異不顯著（均方=9.067，P>0.05），僅在BbMQ09和Bbcaasipp-Lv菌株中相對(duì)較高。KMO test和Bartlett test檢測(cè)結(jié)果表明Bbchitinase 1表達(dá)水平與菌株的MMT和LT50呈顯著負(fù)相關(guān)（圖4），呈阻滯曲線模型，方程見(jiàn)表3，可以通過(guò)檢測(cè)Bbchitinase 1的表達(dá)水平來(lái)作為菌株侵染毒力的量化指標(biāo)。而B(niǎo)bchitinase 2的表達(dá)水平與侵染毒力無(wú)顯著相關(guān)性，推測(cè)Bbchitinase 2可能參與其他生理功能。

2.3? Bbchitinase 1和Bbchitinase 2的生物信息學(xué)分析

2.3.1? 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)? 應(yīng)用鄰接法（neighbor joining， NJ）和MEGA 7.0軟件構(gòu)建了Bbchitinase 1和Bbchitinase 2的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明Bbchitinase 1和Bbchitinase 2親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分別與蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因（endochitinase，CCM05744，GeneBank登錄號(hào)：XM006670888）和木霉（Trichoderma sp.）幾丁質(zhì)酶基因（GeneBank登錄號(hào)：XM006968075）親緣關(guān)系最近（圖5）。

and Bbchitinase 2

2.3.2? 蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)? 將Bbchitinase 1和Bbchitinase 2基因的編碼氨基酸序列輸入SMART在線分析軟件。二者均屬于18家族幾丁質(zhì)酶，但是含有不同的Glyco-18結(jié)構(gòu)域，分別屬于Chitinase A families和Chitinase families 2個(gè)不同的家族。進(jìn)一步用SWISS-MODEL在線分析軟件構(gòu)建了二者的三維模型（圖6），Bbchitinase 1和Bbchitinase 2蛋白具有不同的三維結(jié)構(gòu)：Bbchitinase 1和Bbchitinase 2都含有內(nèi)切幾丁質(zhì)酶催化域（橙色），但是活性中心（輔助催化）結(jié)構(gòu)有顯著差異（紅色），Bbchitinase 2含有一個(gè)β發(fā)卡結(jié)構(gòu);Bbchitinase 1和Bbchitinase 2均無(wú)典型的幾丁質(zhì)酶結(jié)合域，但是具有特殊的輔助結(jié)構(gòu)域（藍(lán)色）;Bbchitinase 1的輔助結(jié)構(gòu)域?yàn)棣?α-α結(jié)構(gòu)，而B(niǎo)bchitinase 2為β-α-α-β結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果說(shuō)明它們可能識(shí)別并結(jié)合不同的輔助蛋白而催化降解不同來(lái)源的幾丁質(zhì)，在球孢白僵菌侵染家蠶過(guò)程中起到不同的作用。

2.4? Bbchitinase 1和Bbchitinase 2的時(shí)空表達(dá)模式

依據(jù)2.3的結(jié)果，進(jìn)一步檢測(cè)了Bbchitinase 1和Bbchitinase 2在球孢白僵菌侵染家蠶過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)模式，Bbchitinase 1在球孢白僵菌侵染家蠶2齡幼蟲(chóng)12～24 h后顯著上調(diào)表達(dá)，30 h后回到正常表達(dá)水平（圖7A）;而B(niǎo)bchitinase 2則在侵染幼蟲(chóng)18～30 h后上調(diào)表達(dá)，而后回到正常水平，最后在侵染家蠶2齡幼蟲(chóng)54 h后顯著上調(diào)表達(dá)，直至幼蟲(chóng)死亡（84 h）（圖7B）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明Bbchitinase 1和Bbchitinase 2在球孢白僵菌侵染家蠶過(guò)程中可能起到不同的作用。

3? 討論

球孢白僵菌侵染宿主昆蟲(chóng)的過(guò)程分為孢子附著萌發(fā)、侵入釘形成和體壁穿透以及體內(nèi)定植與致死等3個(gè)階段，其中體壁穿透是侵染成功與否的關(guān)鍵前提[15]。昆蟲(chóng)體壁由外表皮、前表皮、后表皮、皮質(zhì)層組成，前表皮和后表皮是昆蟲(chóng)體壁的主要組成部分，由幾丁質(zhì)和少量嵌入蛋白構(gòu)成，形成了昆蟲(chóng)體壁的剛性結(jié)構(gòu)和防御功能[16]。一般認(rèn)為球孢白僵菌通過(guò)分泌胞外幾丁質(zhì)酶降解昆蟲(chóng)體壁進(jìn)而完成侵染過(guò)程。

本研究結(jié)果表明，抑制球孢白僵菌菌株胞外幾丁質(zhì)酶活性會(huì)顯著降低其侵染毒力（圖1），相關(guān)性分析結(jié)果也表明，Bbcaasipp-Hv、HN6、BbMQ04、B8菌株的侵染毒力與胞外幾丁質(zhì)酶活性呈顯著正相關(guān)（圖2）;而B(niǎo)bMQ09和Bbcaasipp-Lv菌株胞外幾丁質(zhì)酶活性雖高，但侵染毒力卻相對(duì)較低（表1，表2）。

球孢白僵菌在侵染宿主昆蟲(chóng)過(guò)程中分泌了2種幾丁質(zhì)酶Bbchitinase 1和Bbchitinase 2[10]。實(shí)時(shí)定量分析結(jié)果表明Bbchitinase 1在不同菌株間的表達(dá)水平差異顯著且與菌株侵染毒力呈顯著正相關(guān)（圖4，R2=0.98），因此可以通過(guò)檢測(cè)Bbchitinase 1的表達(dá)水平作為菌株侵染毒力的量化指標(biāo)。而B(niǎo)bchitinase 2在不同菌株間表達(dá)水平差異不顯著，僅在BbMQ09和Bbcaasipp-Lv菌株中偏高一些，且與侵染毒力無(wú)顯著相關(guān)性，可能參與其他生理功能。幾丁質(zhì)酶抑制劑對(duì)Bbchitinase 1和Bbchitinase 2均有抑制作用，因此抑制劑處理后，菌株的Bbchitinase 1酶活性顯著降低，導(dǎo)致侵染毒力顯著降低;而B(niǎo)bMQ09和Bbcaasipp-Lv菌株胞外幾丁質(zhì)酶多為Bbchitinase 2，而B(niǎo)bchitinase 1含量較低，因此雖然BbMQ09和Bbcaasipp-Lv菌株胞外總幾丁質(zhì)酶活性較高，但菌株的侵染毒力卻較低，因此成為酶活性與侵染毒力相關(guān)性分析中的異質(zhì)因子（圖2）。

研究表明，蟲(chóng)生真菌幾丁質(zhì)酶在形態(tài)建成、菌絲發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)代謝、自溶繁殖、體壁侵染等過(guò)程中起到不同的作用[17]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析和時(shí)空表達(dá)模式分析進(jìn)一步探索了Bbchitinase 1和Bbchitinase 2的功能。

Fang等[18]研究發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌的幾丁質(zhì)酶基因序列與其他昆蟲(chóng)真菌存在顯著差異。通過(guò)構(gòu)建球孢白僵菌Bbchitinase 1和Bbchitinase 2的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，Bbchitinase 1和Bbchitinase 2親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（遺傳距離>1.4）。Bbchitinase 1與蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因（endochitinase，CCM05744，GeneBank登錄號(hào)：XM006670888）親緣關(guān)系最近（遺傳距離<0.1）;而與Bbchitinase 2親緣關(guān)系最近的是木霉（Trichoderma sp.）幾丁質(zhì)酶基因（GeneBank登錄號(hào)：XM006968075），但遺傳距離>0.2（圖5）。以上結(jié)果說(shuō)明二者應(yīng)該具有不同的功能并參與不同的代謝過(guò)程。

幾丁質(zhì)酶按照一級(jí)氨基酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)差異分為Chitinase 18和Chitinase 19兩個(gè)大家族，以Chitinase 18家族基因分布最廣泛[17， 19]。二級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果表明Bbchitinase 1和Bbchitinase 2雖然都屬于Chitinase 18家族，但是分屬于2個(gè)不同的亞型：Glyco_hydro_18和Glyco_18。

為進(jìn)一步分析二者的結(jié)構(gòu)差異并了解其功能差異，構(gòu)建了Bbchitinase 1和Bbchitinase 2的三維結(jié)構(gòu)模型（圖6）。大多數(shù)幾丁質(zhì)酶包涵催化域和結(jié)合域，根據(jù)催化域分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和外切幾丁質(zhì)酶;結(jié)合域一般有2個(gè)功能：一是識(shí)別和結(jié)合幾丁質(zhì)，二是破壞幾丁質(zhì)晶體的氫鍵[8， 20]。從三維模型可以看出Bbchitinase 1和Bbchitinase 2都含有內(nèi)切幾丁質(zhì)酶催化域（橙色），均為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶;但Bbchitinase 2的輔助催化活性中心（紅色）比Bbchitinase 1多了一個(gè)β發(fā)卡結(jié)構(gòu)，說(shuō)明二者具有不同的催化功能。此外，區(qū)別于纖維素酶的β-β-α-β結(jié)合域，球孢白僵菌Bbchitinase 1和Bbchitinase 2沒(méi)有典型的結(jié)合域，但是具有特殊的輔助結(jié)構(gòu)域（圖7，藍(lán)色結(jié)構(gòu)區(qū)域）。范艷華[8]研究表明Anopheles gambiae圍食膜結(jié)合蛋白與幾丁質(zhì)酶1結(jié)合才能特異性識(shí)別幾丁質(zhì)，因此球孢白僵菌內(nèi)應(yīng)該存在特殊的配體蛋白，與Bbchitinase 1和Bbchitinase 2的輔助結(jié)構(gòu)域結(jié)合而發(fā)揮幾丁質(zhì)的降解作用。此外，Bbchitinase 1的輔助結(jié)構(gòu)域（藍(lán)色）為β-α-α結(jié)構(gòu)，有利于幾丁質(zhì)酶在宿主體壁幾丁質(zhì)表面富集[17];而B(niǎo)bchitinase 2為β-α-α-β結(jié)構(gòu)，可能識(shí)別并結(jié)合不同的配體蛋白，而后催化降解不同來(lái)源的幾丁質(zhì)，參與不同的生理功能。

Hou等[21]研究表明球孢白僵菌侵入家蠶的過(guò)程中，8～12 h為孢子附著和萌發(fā)階段，13～28 h為侵入釘形成和穿透體壁階段，29～45 h為芽生孢子發(fā)育增殖階段，46 h后為營(yíng)養(yǎng)菌絲發(fā)育和增殖階段。時(shí)空表達(dá)模式分析結(jié)果表明，Bbchitinase 1在侵染家蠶2齡幼蟲(chóng)12～24 h后顯著上調(diào)表達(dá)（圖7A）;而B(niǎo)bchitinase 2則在侵染幼蟲(chóng)18～30 h以及54～84 h后顯著上調(diào)表達(dá)，直至幼蟲(chóng)死亡（84 h）（圖7B）;說(shuō)明Bbchitinase 1主要參與侵入釘形成和體壁穿透功能，而B(niǎo)bchitinase 2可能參與芽生孢子和營(yíng)養(yǎng)菌絲的發(fā)育生殖。

本研究明晰了球孢白僵菌Bbchitinase 1和Bbchitinase 2在侵染宿主過(guò)程中的作用分工;建立了以Bbchitinase 1表達(dá)水平為菌株侵染毒力量化指標(biāo)的數(shù)學(xué)模型;發(fā)現(xiàn)Bbchitinase 2可能參與芽生孢子和營(yíng)養(yǎng)菌絲的發(fā)育生殖過(guò)程;結(jié)果將為其他高毒力、穩(wěn)定性生防真菌的篩選提供重要科學(xué)依據(jù)，對(duì)提升真菌生防制劑的田間應(yīng)用效果具有重要意義。然而，Bbchitinase 1和Bbchitinase 2輔助結(jié)合蛋白和作用底物以及誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制等問(wèn)題還有待深入分析。

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責(zé)任編輯：謝龍蓮