杜致輝 楊瀾 姚新轉(zhuǎn) 陳之林

摘 ?要：FT（FLOWERING LOCUS T）基因是植物開花調(diào)控過程中的關(guān)鍵整合基因。為探明黑喉石斛（Dendrobium ochreatum）FT同源基因功能及其在黑喉石斛嫩莖開花過程中扮演的角色，本研究以黑喉石斛為試驗(yàn)材料，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，克隆得到黑喉石斛FT同源基因，命名為DoFT1。DoFT1基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為537?bp，共編碼178個(gè)氨基酸;生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該基因編碼的蛋白屬于PEBP家族蛋白，其含有關(guān)鍵保守氨基酸位點(diǎn)Tyr84和11個(gè)連續(xù)保守氨基酸殘基序列，為FT同源基因;進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，DoFT1氨基酸序列與鐵皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭同源基因親緣關(guān)系較近;Real-time PCR分析結(jié)果顯示，DoFT1主要在黑喉石斛葉片部位表達(dá)，其表達(dá)量在花芽開始分化階段出現(xiàn)上調(diào)，并在花芽成熟期達(dá)到峰值后呈下降趨勢(shì);將DoFT1導(dǎo)入煙草中超量表達(dá)，可以顯著促進(jìn)煙草提前開花。

關(guān)鍵詞：黑喉石斛;DoFT1基因;嫩莖開花;成花誘導(dǎo)中圖分類號(hào)：Q789??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Expression Pattern Analysis of Dendrobium ochreatum?DoFT1 Gene During Flower Development and Its Functional Verification

DU Zhihui¹， YANG Lan¹， YAO Xinzhuan²， CHEN Zhilin^1*

1. Guizhou Horticulture Institute， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang， Guizhou 550006， China; 2. Tea College， Guihzou University， Guiyang， Guizhou 550025， China

Abstract： TheFLOWERING LOCUS T （FT） gene plays a key role in integrating flowering signals in plants.To study the function of the?FT homologous gene and its role in tender stem flowering ofDendrobium Ochreatum， theFT homologous gene， named asDoFT1， was cloned from?Den. Ochreatumon the basis of transcriptome sequencing results.DoFT1 contained a 537 bp open reading frame which encoding 178 amino acids. Bioinformatic analysis showed that the DoFT1 belonged to the PEBP family， the conserved key amino acid residue Tyr84 and 11-AA stretch of?FT homologs were identified in DoFT1. Phylogenetic tree results showed that DoFT1 was closely related to DcFT inDendrobium candidum and PeFT inPhalaenopsis Equestris. Real-time PCR results indicated that the expression ofDoFT1 was mainly located in leaf tissues， and its expression level was up-regulated during the flower bud differentiation?phase， then showed a downward trend after reaching its peak at the flower bud phase. Over-expression ofDoFT1 in transgenic tobacco plants resulted in earlier flowering compared to wild-type plants.

Keywords： Dendrobium ochreatum;DoFT1gene; tender stem flowering; flower induction

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.006

黑喉石斛（Dendrobium ochreatum）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（DendrobiumSw.）多年生附生草本植物^[1]，屬于春石斛。相比于大多石斛只能在2年生老莖上開花，黑喉石斛在新長(zhǎng)出的嫩莖上就能抽出花序并開花^[2]，其開花時(shí)間明顯早于其他春石斛，是珍貴的育種親本，也是研究石斛早開花機(jī)理的重要材料。

花期調(diào)控是石斛生產(chǎn)中的關(guān)鍵技術(shù)，也是近年研究的熱點(diǎn)^[3]?；òl(fā)育主要分為成花誘導(dǎo)、花發(fā)端及花器官發(fā)育3個(gè)階段。其中，植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換即成花誘導(dǎo)是植物發(fā)育中最顯著的過程，也是植物繁殖的關(guān)鍵事件^[4-6]。在成花誘導(dǎo)過程中已知的成花誘導(dǎo)途徑有光周期途徑（photoperiodic pathway）、春化途徑（vernalization pathway）、赤霉素途徑（GA gibberellin pathway）和自主調(diào)控途徑（autonomous pathway）等^[7-8]。而FT作為開花途徑中的重要整合因子，其同源基因的結(jié)構(gòu)與功能在不同物種之間高度保守。

目前關(guān)于FT及其相關(guān)基因在擬南芥等模式植物開花過程中的表達(dá)模式與作用機(jī)制的研究已較為深入，FT作為多條開花途徑的信號(hào)整合因子受其上游基因CO的調(diào)控，在植物葉片中表達(dá)后通過韌皮部運(yùn)輸至莖尖分生組織，結(jié)合FD蛋白后激活其下游基因AP1和SOC1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物的成花轉(zhuǎn)變^[9]。而在蘭科植物的相關(guān)研究中，Li等^[10]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中超量表達(dá)金釵石斛DnFT基因可以通過調(diào)控AP1和LHY促進(jìn)擬南芥提前開花。孫崇波等^[11]的研究表明轉(zhuǎn)蕙蘭CfFT基因煙草植株的開花提前時(shí)間與該基因在轉(zhuǎn)化植株中的表達(dá)量呈正相關(guān)。黃瑋婷等^[12]發(fā)現(xiàn)墨蘭CsFT基因具有擬南芥同源基因類似的促進(jìn)開花的作用。但關(guān)于黑喉石斛FT同源基因功能的研究仍未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)黑喉石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，FT同源基因同時(shí)參與了生物節(jié)律鐘、光周期、生殖轉(zhuǎn)換3個(gè)開花重要生物過程。所以，本研究以黑喉石斛為材料，克隆得到了其FT同源基因DoFT1，分析該基因在黑喉石斛開花前后不同部位的表達(dá)模式，并進(jìn)一步構(gòu)建超量表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)其功能進(jìn)行初步驗(yàn)證。為明確其在黑喉石斛成花誘導(dǎo)過程中的作用，探明黑喉石斛開花機(jī)制提供新的參考。

1??材料與方法

1.1材料

本研究所用材料黑喉石斛（Dendrobium ochreatum）由貴州省園藝研究所保存并提供。植物表達(dá)載體pSH 737、農(nóng)桿菌LBA 4404、普通煙草（Nicotiana tabacumL.）栽培品種‘Xanthi由貴州大學(xué)山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1?DoFT1的克隆??結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果和GenBank中多個(gè)FT同源基因序列比對(duì)結(jié)果，使用DNASTAR設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。DoFT F：5?-?GGAGAGAACACGGGGGACTCTAGA-3?，DoFT R：5?-CGTACCGAATTCGAGCTCGGTACC-3?，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以黑喉石斛不同時(shí)期葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1?μL、上游引物DoFT F 1?μL、下游引物DoFT R 1?μL、PCR Mix 10?μL和ddH₂O 7?μL，共20?μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4?℃?5?min預(yù)變性;94?℃?30?s，55?℃?40?s，72?℃?1?min，35個(gè)循環(huán);72?℃延伸3?min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，進(jìn)行膠回收實(shí)驗(yàn)并連接T₄載體，遺傳轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)并送出測(cè)序。拼接測(cè)序結(jié)果后獲得該基因cDNA全長(zhǎng)序列。

1.2.2?DoFT1的生物信息學(xué)分析??采用BALST分析DoFT1基因的氨基酸序列同源性，下載相似性較高的其他植物同源氨基酸序列，使用MEGA 6.0軟件根據(jù)相鄰連接方法（neighbor jointing，NJ）構(gòu)建DoFT1系統(tǒng)進(jìn)化樹并分析;通過ExPASy Proteomics Server在線軟件ProtParam分析其理化性質(zhì)，分別使用SOMPA和SWISS MODEL預(yù)測(cè)其二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3?DoFT1及其相關(guān)基因的表達(dá)模式分析??采用華越洋RNA提取試劑盒分別提取黑喉石斛營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段、花芽分化階段、花芽階段和開花階段4個(gè)階段的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)DoFT1基因的表達(dá)情況，根據(jù)DoFT1基因的cDNA全長(zhǎng)序列，運(yùn)用DNASTAR設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex?Taq（2×） 10?μL、上游引物DoFT1 RF 1?μL、下游引物DoFT RR 1?μL、cDNA 1?μL、ddH₂O 7 μL，共20?μL。于冰上配制反應(yīng)液，置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣品3次重復(fù)。反應(yīng)完成后計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 ?轉(zhuǎn)DoFT1基因植株的獲得及開花觀察期 ?獲得DoFT1編碼區(qū)序列后，在其5?端和3?分別加入XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)序列，送由上海旭冠生物公司合成后通過雙酶切反應(yīng)連接至pSH 737植物表達(dá)載體，得到pSH-35S-DoFT載體，該載體含有35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS：：NPT II作為報(bào)告基因。通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA 4404，以葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化模式植物煙草。對(duì)經(jīng)過鑒定的轉(zhuǎn)基因煙草植株開花情況進(jìn)行觀察。

2 ?結(jié)果與分析

2.1黑喉石斛DoFT1基因序列全長(zhǎng)克隆及分析

以黑喉石斛不同時(shí)期葉片cDNA為模板，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序拼接結(jié)果和GenBank中多個(gè)FT同源基因序列設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，得到一條約500?bp大小的基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后，連接T載體后測(cè)序，拼接后獲得黑喉石斛FT基因cDNA全長(zhǎng)序列585?bp。序列分析結(jié)果表明，該基因包含1個(gè)長(zhǎng)度為537?bp的完整開放閱讀框， 編碼178個(gè)氨基酸殘基。

其氨基酸序列BLAST比對(duì)結(jié)果表明（圖2），該基因氨基酸序列包含DPPAP和GIHR等模塊，

具有磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidyletha- nolamine-binding protein， PEBP）家族典型功能結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步比對(duì)其與2個(gè)蘭科近緣物種氨基酸序列（圖3），發(fā)現(xiàn)其含有關(guān)鍵保守氨基酸位點(diǎn)Tyr84和對(duì)FT活性起關(guān)鍵作用的11個(gè)保守氨基酸殘基序列，為FT同源基因，命名為DoFT1。

DoFT1編碼的蛋白質(zhì)分子式為C₈₈₇H₁₃₆₅N₂₅₁O₂₅₇S₇，原子總數(shù)為2767，預(yù)測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量為19.88?kDa，等電點(diǎn)為5.69。分析結(jié)果顯示，此蛋白含有20個(gè)纈氨酸（Val），占氨基酸總數(shù)的11.2%;含有16個(gè)甘氨酸（Gly），占氨基酸總數(shù)

DcFT：鐵皮石斛（XP_020702366.1）;PeFT：小蘭嶼蝴蝶蘭（XP_020576922.1）;具有一致性和相似性的氨基酸分別用深藍(lán)色和淺藍(lán)色表示;方框?yàn)镻EBP家族蛋白和FT蛋白保守結(jié)構(gòu)域，Y為FT蛋白關(guān)鍵保守氨基酸位點(diǎn)Tyr84。

DcFT：Dendrobium catenatum （XP_020702366.1）; PeFT：Phalaenopsis equestris （XP_020576922.1）; The identity and similarityamino acid sequences are marked by dark blue and light blue， respectively. The boxes are conservative elements of PEBP proteinfamily and FT protein， the Y are key conservative amino acid sites Tyr84 of FT protein.的9%;不含有吡咯賴氨酸（Pyl）以及硒半胱氨酸（Sec）。親水性平均系數(shù)為–0.248，為親水性蛋白。

通過SOMPA軟件分析DoFT1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有13.48%的α-螺旋、25.84%的延伸鏈、5.06%的?β-折疊和55.62%的無規(guī)則卷曲。BLAST和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)DoFT蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)具有典型的PEBP基因家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中心具有1個(gè)大的由5個(gè)反向平行肽鏈組成的β-折疊區(qū)域。此外，其N端有1個(gè)α-螺旋、1個(gè)β-折疊，C端有1個(gè)α-螺旋。

2.2 ?黑喉石斛DoFT1基因氨基酸序列進(jìn)化分析

通過NCBI中的BLAST在線軟件將DoFT1

推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行搜索比對(duì)（圖4），發(fā)現(xiàn)DoFT1與鐵皮石斛FT基因氨基酸序列具有較高的同源性和一致性，序列一致性為96%;其次為小嶼蝴蝶蘭，其氨基酸序列一致性為94%;此外，DoFT1與月季、郁金香、水仙、蘋果等10個(gè)物種的FT氨基酸序列相似性皆在80%以上，說明FT基因在其長(zhǎng)期進(jìn)化中的保守性。采用MEGA 6.0軟件對(duì)DoFT1基因編碼的氨基酸序列和GenBank收錄的12種植物的同源序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，聚類后進(jìn)行分析，結(jié)果表明黑喉石斛首先與小蘭嶼蝴蝶蘭、鐵皮石斛等蘭科植物親緣關(guān)系最為接近，然后與郁金香、菠蘿、水仙等單子葉植物FT同源氨基酸歸為一類。

2.3黑喉石斛DoFT1基因表達(dá)模式

圖5為黑喉石斛不同階段形態(tài)特征，利用Real-time PCR技術(shù)分析黑喉石斛自然開花過程不同組織中DoFT1基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明：DoFT1基因主要在葉片中表達(dá)，隨著黑喉石斛從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期向生殖生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)換，DoFT1的表達(dá)量在花芽分化期出現(xiàn)上調(diào)，并在花芽形成期達(dá)到峰值，最終在開花期出現(xiàn)下調(diào)（圖6）。此外，開花期時(shí)，DoFT1在葉片和花器官中均有所表達(dá)，但葉片的表達(dá)量遠(yuǎn)高于花器官，而在花芽中則未檢出DoFT1基因的表達(dá)（圖7）。

2.4黑喉石斛DoFT1基因遺傳轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)化植株的表型分析

將得到的抗性幼苗植株移栽至營(yíng)養(yǎng)土中，取4～6葉期抗性煙苗的葉片進(jìn)行GUS化學(xué)組織染色。提取GUS染色陽性植株葉片總DNA，以DoFT1基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在抗性植株中擴(kuò)增得到500?bp左右的特異性條帶（圖8）。經(jīng)鑒定，最終獲得20余株T₀代轉(zhuǎn)DoFT1基因煙草株系。選取其中開花較早的株系提取總RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終篩選出2個(gè)超量表達(dá)DoFT1基因的煙草株系。

收取篩選得到的T₀代轉(zhuǎn)DoFT1基因煙草株系種子，播種后再次經(jīng)過鑒定得到T₁代轉(zhuǎn)DoFT1基因煙草植株，對(duì)其開花性狀進(jìn)行觀察（圖9）。結(jié)果表明（表1），在正常光照條件下，轉(zhuǎn)基因煙草植株的開花期相比于野生型植株提前了15?d，而轉(zhuǎn)基因植株的盛開期（50%植株開花）相比于野生型提前了13?d。初步推測(cè)DoFT1基因的超量表達(dá)在正常光照條件下可以促進(jìn)植株提前開花。

3??討論

目前黑喉石斛的研究主要集中在多倍體誘導(dǎo)^[13]和試管苗開花^[2]等技術(shù)層面，尚未見到有關(guān)其開花基因的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期已完成黑喉石斛無參考基因組試管開花組培苗與對(duì)照樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作，分析對(duì)照組差異顯著基因發(fā)現(xiàn)，有7440個(gè)基因參與到黑喉石斛花發(fā)育過程，其中直接參與成花誘導(dǎo)的基因有94個(gè)，包括光周期及自主途徑上的促進(jìn)基因和抑制基因。如CRY1、CRY2、GI、CO、FT、FD、SOC1、LFY、AP1等促進(jìn)開花轉(zhuǎn)型基因均上調(diào)，SVP、CCA1、LHY、CDF、SPA1等抑制基因顯著下調(diào)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)FT同源基因同時(shí)參與了生物節(jié)律鐘、光周期、生殖轉(zhuǎn)換3個(gè)開花重要生物過程。

為探究FT基因?qū)诤硎_花機(jī)制的調(diào)控作用，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果在黑喉石斛葉片中克隆得到了FT同源基因DoFT1。序列BLAST結(jié)果表明，該基因的序列與鐵皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭FT同源基因編碼的氨基酸序列具有較高的一致性，分別為96%和94%，與月季、郁金香等10種植物的相對(duì)應(yīng)氨基酸序列相似性皆在80%以上，說明不同物種FT基因序列較為保守^[14]。對(duì)黑喉石斛DoFT1氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)具有DDPxD和GxHR等典型PEBP家族蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域^[15]，這些保守序列均與磷脂酰乙醇胺的結(jié)合位點(diǎn)形成有關(guān)。同源序列比對(duì)結(jié)果表明，其序列含有關(guān)鍵保守氨基酸位點(diǎn)Tyr84和對(duì)FT活性起關(guān)鍵作用的11個(gè)保守氨基酸殘基序列^[10]，說明本研究克隆得到的DoFT1基因?yàn)?em>FT同源基因。

不同植物中FT同源基因的表達(dá)模式有一定區(qū)別。如擬南芥和水稻的FT同源基因在葉片中表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物移動(dòng)到莖尖組織之后與FLOWERING LOCUS D （FD）等蛋白結(jié)合后促進(jìn)開花^[16-18];荔枝FT同源基因僅在葉片中表達(dá)，遺傳轉(zhuǎn)化模式植物煙草后部分轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)早花表型^[19];而黃瓜FT同源基因在花器官和果實(shí)中表達(dá)，在葉片中不表達(dá)^[20]。本研究發(fā)現(xiàn)DoFT1基因在黑喉石斛的葉片組織中表達(dá)量最高，在花器官中表達(dá)量少，在花芽中未檢測(cè)出表達(dá)量，與擬南芥和荔枝FT同源基因的表達(dá)模式相似。不同發(fā)育時(shí)期的葉片組織中，DoFT1基因表達(dá)量在花芽始分化階段出現(xiàn)上調(diào)，在花芽形成時(shí)期的基因的表達(dá)量達(dá)到最高，開花后該基因的表達(dá)量下降。這與文心蘭OnFT基因的表達(dá)量在其葉片中隨著成熟度的增長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的表達(dá)模式相似^[14]。本研究構(gòu)建了DoFT1的過表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法導(dǎo)入煙草中。觀察T₁代轉(zhuǎn)基因煙草植株的開花性狀，發(fā)現(xiàn)其整體呈現(xiàn)早花趨勢(shì)。與擬南芥^[16]、水稻^[17-18]、蕙蘭^[11]、墨蘭^{[12， 21]}等物種中的FT同源基因具有相似的正向調(diào)控開花作用。初步推測(cè)黑喉石斛中的DoFT1可能在成花誘導(dǎo)和花發(fā)端過程中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆獲得了黑喉石斛FT同源基因DoFT1序列，序列分析結(jié)果表明該基因?yàn)殍F皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭FT基因的同源基因。熒光定量分析結(jié)果表明該基因主要在黑喉石斛葉片中表達(dá)，且在花芽分化形成期葉片中表達(dá)量最高。將DoFT1導(dǎo)入煙草中超量表達(dá)，可以使煙草開花時(shí)間明顯提前。該結(jié)果為探明DoFT1在黑喉石斛嫩莖成花機(jī)制中的作用提供參考。

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責(zé)任編輯：崔麗虹