陳愛芳,肖 強(qiáng)

(1.武漢光谷人福生物醫(yī)藥有限公司,湖北 武漢 430074；2.武漢東湖高新集團(tuán)股份有限公司,湖北 武漢 430073)

抗菌無(wú)紡布在日常生活中應(yīng)用廣泛，與人們生活息息相關(guān)，尤其在醫(yī)療健康領(lǐng)域，在維護(hù)人類健康和預(yù)防感染中，發(fā)揮著重要作用。無(wú)紡布也稱非織造布，是由定向的或隨機(jī)的纖維組成。在生活中棉無(wú)紡布應(yīng)用最為廣泛。我們對(duì)棉無(wú)紡布的使用幾乎滲透到每一個(gè)角落，并且棉無(wú)紡布相比其他材料制品，具有質(zhì)地柔軟、來源廣泛、吸濕性好、強(qiáng)度適中、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于一次性醫(yī)療口罩、一次性防護(hù)衣等的制造[1]。

抗菌材料是一類新型功能材料，其本身就具有殺死或者抑制細(xì)菌、真菌等微生物作用。市場(chǎng)上目前各類抗菌材料琳瑯滿目，不勝枚舉，但主要分為兩類：無(wú)機(jī)抗菌材料和有機(jī)抗菌材料。無(wú)機(jī)抗菌材料主要是將金屬類離子與其他載體材料加以復(fù)合從而賦予材料抗菌功能，這些金屬類離子包括Ag+、Cu2+、Zn2+、Mg2+等。這些金屬離子以納米形態(tài)附著在材料上，增加了材料的比表面積，可以更好的吸附細(xì)菌等微生物，因此具有良好的抗菌效果。有機(jī)抗菌材料主要包括天然抗菌材料、低分子抗菌材料和高分子抗菌材料。有機(jī)抗菌材料的抗菌機(jī)理：通過某些元素所帶的電荷破壞微生物細(xì)胞膜和細(xì)胞結(jié)構(gòu)、滲透進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部并吸附細(xì)胞內(nèi)含陰離子的物質(zhì)，擾亂細(xì)胞正常的生理活動(dòng)從而達(dá)到殺菌的效果[2]。

本文旨在通過多巴胺做為表面處理劑[3-4]接枝銀離子吸附在無(wú)紡布表面，使原本的棉無(wú)紡布具有抗菌和耐洗牢度好等功能，不僅解決了以往純棉無(wú)紡布的缺陷，還賦予了普通棉無(wú)紡布更大的附加值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

主要試劑和材料：棉無(wú)紡布，廣州美博城；鹽酸多巴胺 (DA)，硝酸銀，三羥甲基氨基甲烷(TRIS)，上海阿拉丁試劑有限公司；胰蛋白胨，酵母膏，瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；大腸桿菌(ATCC 25922)，金黃色葡萄球菌 (ATCC 25923) 南京便診生物科技有限公司；化學(xué)試劑均為分析純。

主要儀器：多功能酶標(biāo)儀Synergy HTX，美國(guó)博騰儀器有限公司；JSW-6519LV型掃描電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀,德國(guó)Bruker公司。

1.2 多巴胺改性純棉無(wú)紡布的制備

將濃度為0.02 mol/L的鹽酸多巴胺加入到濃度為 10 mmol/L 的Tris溶液中，并用 1 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)多巴胺緩沖液的pH值為8.5～8.8。由于多巴胺的自聚反應(yīng)對(duì)pH值的變化非常敏感，因此需要嚴(yán)格控制pH值。

將洗凈烘干的純棉無(wú)紡布完全浸入到多巴胺緩沖溶液中，密封后放在 30 ℃，100 r/min的恒溫水浴搖床中反應(yīng) 24 h，取出洗凈后放入 60 ℃ 的烘箱中干燥 30 min 備用。將處理好的純棉無(wú)紡布浸入到 100 mL、濃度為 0.03 mol/L 硝酸銀溶液中，用鋁箔紙完全包裹以形成避光環(huán)境，避免光照造成硝酸銀的分解。在恒溫水浴振蕩箱中振蕩反應(yīng) 24 h，溫度為 30 ℃。取出洗凈在 60 ℃ 烘箱內(nèi)烘干后備測(cè)[5]。

1.3 多巴胺改性純棉無(wú)紡布抗菌性能測(cè)試

抗菌性能通過檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線和試樣的抑菌圈來判定多巴胺改性無(wú)紡布是否具有抗菌性。

將大腸桿菌活化計(jì)數(shù)后，把濃度調(diào)為 5×105CFU/mL。選取 100 mL 的無(wú)菌錐形瓶5個(gè)，分別加入 10 mL 無(wú)菌LB培養(yǎng)液和 100 μL 、濃度為5×105CFU/mL 的大腸桿菌，并標(biāo)記為：空白，D1，D2，A1，A2?？瞻捉M為未經(jīng)任何處理的純棉無(wú)紡布；D1、D2兩組為僅經(jīng)過多巴胺處理的無(wú)紡布；A1、A2兩組為多巴胺和硝酸銀先后處理的無(wú)紡布。將備好的試樣加入瓶中后放在37 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。每隔1 h取樣1次，用Synergy HTX 多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)菌液的OD600值，測(cè)4次后；然后每隔2 h再測(cè)4次；接著間隔12 h檢測(cè)2次。該測(cè)試共需36 h，共檢測(cè)10個(gè)時(shí)間點(diǎn)。將這10個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)根據(jù)培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)做成曲線便可得到細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線[6]。

將準(zhǔn)備的LB瓊脂平板取出，用 1 mL 移液槍頭從活化的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中吸取 100 μL 菌液至平板中，用涂布棒將菌液均勻推開至整個(gè)平板，來回多次推涂直至平板上沒有菌液流動(dòng)。用鑷子將樣品圓片均勻分散放在平板上，放好后將蓋子蓋上，底部朝上放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 多巴胺改性純棉無(wú)紡布性能表征

通過掃描電子顯微鏡(SEM)表征樣品表面形貌，酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)菌在各個(gè)時(shí)期的生長(zhǎng)狀況，傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)通過傅里葉變換對(duì)信號(hào)進(jìn)行處理得到透過率或者吸光度隨波數(shù)或者波長(zhǎng)的紅外吸收光譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚多巴胺-納米銀的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 掃描電子顯微鏡表征

從圖1中的三組電鏡圖看出,空白組(A,B)的無(wú)紡布纖維表面十分光滑，沒有黏附任何物質(zhì)，纖維分布雜亂而均勻，是屬于未經(jīng)任何處理的純棉非織造無(wú)紡布。經(jīng)過多巴胺處理的電鏡圖(C,D)中看到，纖維表面黏附著一些顆粒物質(zhì)，這些表面附著的顆粒應(yīng)該是聚多巴胺顆粒，這表明經(jīng)過多巴胺處理后的無(wú)紡布表面還是附著了很多的顆粒，多巴胺處理過程還比較理想。圖1(E,F)經(jīng)放大后可以看到無(wú)紡布表面較(C,D)組附著的顆粒數(shù)量更多、體積更大，這表明納米銀粒子已經(jīng)被包覆在無(wú)紡布表面的聚多巴胺內(nèi)，多巴胺/硝酸銀處理過后無(wú)紡布表面明顯附著有更多的顆粒。

2.1.2 傅里葉變換紅外光譜表征

將未經(jīng)過處理的純棉無(wú)紡布和經(jīng)過多巴胺硝酸銀改性的純棉無(wú)紡布做傅里葉變換紅外光譜測(cè)試，得到兩份紅外光譜圖(圖2)。在兩種樣品的譜圖中，均在1313.4、2895 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，這些吸收峰屬于純棉無(wú)紡布大分子結(jié)構(gòu)的特征吸收譜帶。與未經(jīng)過處理純棉無(wú)紡布的紅外譜圖相比，經(jīng)多巴胺和硝酸銀溶液處理后的純棉無(wú)紡布的紅外光譜圖在553.55、1022.2、1633.6、3271.1 cm-1處的吸收峰峰位都發(fā)生了變化。經(jīng)分析認(rèn)為，在還原納米銀粒子的過程中，聚多巴胺中的部分酚羥基可能被氧化成醌基結(jié)構(gòu)，所以在紅外圖譜中 1633.6 cm-1的吸收峰較另一組峰更寬，強(qiáng)度更低，證明納米銀會(huì)被包裹在聚多巴胺內(nèi)部。純棉無(wú)紡布經(jīng)多巴胺處理后，無(wú)紡布表面會(huì)沉積一層聚多巴胺涂層，聚多巴胺分子中的某些結(jié)構(gòu)使得多巴胺能夠在無(wú)紡布表面緊密貼服，沉積在無(wú)紡布表面的多巴胺具有很好的黏附性和還原能力。通過原位還原反應(yīng)，可將硝酸銀溶液中的Ag+還原、接枝到纖維表面。這步反應(yīng)不僅使純棉無(wú)紡布表面接枝了大量的Ag+，還會(huì)有許多的被還原的納米銀沉積在無(wú)紡布表面[7]。

A.未經(jīng)處理的純棉無(wú)紡布；B.經(jīng)過多巴胺和硝酸銀處理的純棉無(wú)紡布。圖2 紅外光譜圖

2.2 聚多巴胺-納米銀抗菌性能研究

2.2.1 抑菌圈測(cè)試

圖3為純棉無(wú)紡布的抑菌圈測(cè)試圖。其中，D1、D2為僅經(jīng)過多巴胺處理的無(wú)紡布，A1、A2兩組為多巴胺和硝酸銀先后處理無(wú)紡布。

從圖3 A中觀察到，A1、A2兩塊樣品周圍有一個(gè)明顯的無(wú)菌圈，而空白和D1、D2三組樣品周圍均長(zhǎng)滿了大腸桿菌，說明經(jīng)過多巴胺/硝酸銀處理的無(wú)紡布具有顯著的抗菌能力。觀察圖3 B可以得到相同的結(jié)論，并且在這個(gè)抑菌圈測(cè)試中，設(shè)置了3種不同濃度的多巴胺(A1=0.01、A2=0.02、A3=0.03 mol/L)，根據(jù)抑菌圈的大小，可以初步判定：在低濃度情況下，多巴胺濃度越大，多巴胺/硝酸銀處理無(wú)紡布的抑菌性越好。

A.大腸桿菌抑菌圈；B.金色葡萄球菌抑菌圈。圖3 抑菌圈測(cè)試圖

2.2.2 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)試

1.3中五組測(cè)試樣品在36 h內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)試的OD600數(shù)據(jù)，繪制出細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線圖(圖4)，以分析菌液中細(xì)菌的實(shí)際生長(zhǎng)情況。

由圖4可知，A2組試樣對(duì)大腸桿菌的抑制效果可長(zhǎng)達(dá)36 h以上。LB初始平均值為0.201，菌液初始平均值為0.227。與菌液初始值相比，36 h后空白組的OD600值為2.807，增長(zhǎng)了2.58；36 h后D2組的OD600值為2.219，增長(zhǎng)了1.992；36 h后A2組的OD600值為0.270，僅增長(zhǎng)了0.043，這充分證明了聚多巴胺-納米銀改性無(wú)紡布具有很好的抗菌性能，且抗菌持久。觀察三條曲線的走勢(shì)看到，空白組和D2組的走勢(shì)均先是快速增長(zhǎng)，這是因?yàn)樵趬A性條件下，聚多巴胺中的酚羥基發(fā)生電離，粒子間存在靜電排斥作用，這種作用可以使納米銀顆粒更快分散從而不易團(tuán)聚。

空白組為未經(jīng)任何處理的純棉無(wú)紡布；D1、D2為僅經(jīng)過多巴胺處理的無(wú)紡布；A1、A2為多巴胺和硝酸銀先后處理無(wú)紡布。圖4 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線圖

3 結(jié)論

通過多巴胺和硝酸銀溶液先后處理純棉無(wú)紡布得到抗菌無(wú)紡布，具有持久抗菌效果，抗菌時(shí)長(zhǎng)至少可達(dá)36 h，可滿足一次性醫(yī)療口罩和防護(hù)衣的要求。研究發(fā)現(xiàn)，多巴胺首先經(jīng)過氧化聚合形成聚多巴胺，然后聚多巴胺將硝酸銀還原并與其結(jié)合形成聚多巴胺-納米銀，聚多巴胺通過醌基結(jié)構(gòu)與納米銀粒子進(jìn)行相互作用。表征結(jié)果表明，納米銀通過聚多巴胺附著在無(wú)紡布表面，聚多巴胺包裹在納米銀表面，并且聚多巴胺-納米銀在體系中具有良好的分散性和穩(wěn)定性。聚多巴胺-納米銀粒子對(duì)大腸桿菌和金色葡萄球菌均具有優(yōu)良的抑制效果，并具有很好的耐洗牢度[8]。

當(dāng)經(jīng)多巴胺和硝酸銀先后處理過的無(wú)紡布潤(rùn)濕放入菌液后，Ag+和帶正電的納米銀被釋放出來，并通過庫(kù)侖力吸附在微生物的細(xì)胞膜上。由于銀離子具有很高的表面能和分散性，使得納米銀能夠與細(xì)胞膜表面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并破壞細(xì)胞膜的完整性，入侵細(xì)胞內(nèi)部。同時(shí)，因?yàn)锳g+能與細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成沉淀，所以納米銀浸入細(xì)胞內(nèi)后會(huì)阻礙細(xì)胞正常的生理活動(dòng)并最終使細(xì)胞失去分裂繁殖能力而失活[9]。