陳愛芳,肖 強

(1.武漢光谷人福生物醫(yī)藥有限公司,湖北 武漢 430074；2.武漢東湖高新集團股份有限公司,湖北 武漢 430073)

抗菌無紡布在日常生活中應(yīng)用廣泛，與人們生活息息相關(guān)，尤其在醫(yī)療健康領(lǐng)域，在維護人類健康和預(yù)防感染中，發(fā)揮著重要作用。無紡布也稱非織造布，是由定向的或隨機的纖維組成。在生活中棉無紡布應(yīng)用最為廣泛。我們對棉無紡布的使用幾乎滲透到每一個角落，并且棉無紡布相比其他材料制品，具有質(zhì)地柔軟、來源廣泛、吸濕性好、強度適中、價格便宜等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于一次性醫(yī)療口罩、一次性防護衣等的制造[1]。

抗菌材料是一類新型功能材料，其本身就具有殺死或者抑制細菌、真菌等微生物作用。市場上目前各類抗菌材料琳瑯滿目，不勝枚舉，但主要分為兩類：無機抗菌材料和有機抗菌材料。無機抗菌材料主要是將金屬類離子與其他載體材料加以復(fù)合從而賦予材料抗菌功能，這些金屬類離子包括Ag+、Cu2+、Zn2+、Mg2+等。這些金屬離子以納米形態(tài)附著在材料上，增加了材料的比表面積，可以更好的吸附細菌等微生物，因此具有良好的抗菌效果。有機抗菌材料主要包括天然抗菌材料、低分子抗菌材料和高分子抗菌材料。有機抗菌材料的抗菌機理：通過某些元素所帶的電荷破壞微生物細胞膜和細胞結(jié)構(gòu)、滲透進細胞內(nèi)部并吸附細胞內(nèi)含陰離子的物質(zhì)，擾亂細胞正常的生理活動從而達到殺菌的效果[2]。

本文旨在通過多巴胺做為表面處理劑[3-4]接枝銀離子吸附在無紡布表面，使原本的棉無紡布具有抗菌和耐洗牢度好等功能，不僅解決了以往純棉無紡布的缺陷，還賦予了普通棉無紡布更大的附加值。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

主要試劑和材料：棉無紡布，廣州美博城；鹽酸多巴胺 (DA)，硝酸銀，三羥甲基氨基甲烷(TRIS)，上海阿拉丁試劑有限公司；胰蛋白胨，酵母膏，瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；大腸桿菌(ATCC 25922)，金黃色葡萄球菌 (ATCC 25923) 南京便診生物科技有限公司；化學(xué)試劑均為分析純。

主要儀器：多功能酶標儀Synergy HTX，美國博騰儀器有限公司；JSW-6519LV型掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀,德國Bruker公司。

1.2 多巴胺改性純棉無紡布的制備

將濃度為0.02 mol/L的鹽酸多巴胺加入到濃度為 10 mmol/L 的Tris溶液中，并用 1 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)多巴胺緩沖液的pH值為8.5～8.8。由于多巴胺的自聚反應(yīng)對pH值的變化非常敏感，因此需要嚴格控制pH值。

將洗凈烘干的純棉無紡布完全浸入到多巴胺緩沖溶液中，密封后放在 30 ℃，100 r/min的恒溫水浴搖床中反應(yīng) 24 h，取出洗凈后放入 60 ℃ 的烘箱中干燥 30 min 備用。將處理好的純棉無紡布浸入到 100 mL、濃度為 0.03 mol/L 硝酸銀溶液中，用鋁箔紙完全包裹以形成避光環(huán)境，避免光照造成硝酸銀的分解。在恒溫水浴振蕩箱中振蕩反應(yīng) 24 h，溫度為 30 ℃。取出洗凈在 60 ℃ 烘箱內(nèi)烘干后備測[5]。

1.3 多巴胺改性純棉無紡布抗菌性能測試

抗菌性能通過檢測細菌生長曲線和試樣的抑菌圈來判定多巴胺改性無紡布是否具有抗菌性。

將大腸桿菌活化計數(shù)后，把濃度調(diào)為 5×105CFU/mL。選取 100 mL 的無菌錐形瓶5個，分別加入 10 mL 無菌LB培養(yǎng)液和 100 μL 、濃度為5×105CFU/mL 的大腸桿菌，并標記為：空白，D1，D2，A1，A2?？瞻捉M為未經(jīng)任何處理的純棉無紡布；D1、D2兩組為僅經(jīng)過多巴胺處理的無紡布；A1、A2兩組為多巴胺和硝酸銀先后處理的無紡布。將備好的試樣加入瓶中后放在37 ℃、150 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)。每隔1 h取樣1次，用Synergy HTX 多功能酶標儀檢測菌液的OD600值，測4次后；然后每隔2 h再測4次；接著間隔12 h檢測2次。該測試共需36 h，共檢測10個時間點。將這10個點的數(shù)據(jù)根據(jù)培養(yǎng)時長做成曲線便可得到細菌的生長曲線[6]。

將準備的LB瓊脂平板取出，用 1 mL 移液槍頭從活化的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中吸取 100 μL 菌液至平板中，用涂布棒將菌液均勻推開至整個平板，來回多次推涂直至平板上沒有菌液流動。用鑷子將樣品圓片均勻分散放在平板上，放好后將蓋子蓋上，底部朝上放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 多巴胺改性純棉無紡布性能表征

通過掃描電子顯微鏡(SEM)表征樣品表面形貌，酶標儀測定細菌在各個時期的生長狀況，傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)通過傅里葉變換對信號進行處理得到透過率或者吸光度隨波數(shù)或者波長的紅外吸收光譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚多巴胺-納米銀的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 掃描電子顯微鏡表征

從圖1中的三組電鏡圖看出,空白組(A,B)的無紡布纖維表面十分光滑，沒有黏附任何物質(zhì)，纖維分布雜亂而均勻，是屬于未經(jīng)任何處理的純棉非織造無紡布。經(jīng)過多巴胺處理的電鏡圖(C,D)中看到，纖維表面黏附著一些顆粒物質(zhì)，這些表面附著的顆粒應(yīng)該是聚多巴胺顆粒，這表明經(jīng)過多巴胺處理后的無紡布表面還是附著了很多的顆粒，多巴胺處理過程還比較理想。圖1(E,F)經(jīng)放大后可以看到無紡布表面較(C,D)組附著的顆粒數(shù)量更多、體積更大，這表明納米銀粒子已經(jīng)被包覆在無紡布表面的聚多巴胺內(nèi)，多巴胺/硝酸銀處理過后無紡布表面明顯附著有更多的顆粒。

2.1.2 傅里葉變換紅外光譜表征

將未經(jīng)過處理的純棉無紡布和經(jīng)過多巴胺硝酸銀改性的純棉無紡布做傅里葉變換紅外光譜測試，得到兩份紅外光譜圖(圖2)。在兩種樣品的譜圖中，均在1313.4、2895 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，這些吸收峰屬于純棉無紡布大分子結(jié)構(gòu)的特征吸收譜帶。與未經(jīng)過處理純棉無紡布的紅外譜圖相比，經(jīng)多巴胺和硝酸銀溶液處理后的純棉無紡布的紅外光譜圖在553.55、1022.2、1633.6、3271.1 cm-1處的吸收峰峰位都發(fā)生了變化。經(jīng)分析認為，在還原納米銀粒子的過程中，聚多巴胺中的部分酚羥基可能被氧化成醌基結(jié)構(gòu)，所以在紅外圖譜中 1633.6 cm-1的吸收峰較另一組峰更寬，強度更低，證明納米銀會被包裹在聚多巴胺內(nèi)部。純棉無紡布經(jīng)多巴胺處理后，無紡布表面會沉積一層聚多巴胺涂層，聚多巴胺分子中的某些結(jié)構(gòu)使得多巴胺能夠在無紡布表面緊密貼服，沉積在無紡布表面的多巴胺具有很好的黏附性和還原能力。通過原位還原反應(yīng)，可將硝酸銀溶液中的Ag+還原、接枝到纖維表面。這步反應(yīng)不僅使純棉無紡布表面接枝了大量的Ag+，還會有許多的被還原的納米銀沉積在無紡布表面[7]。

A.未經(jīng)處理的純棉無紡布；B.經(jīng)過多巴胺和硝酸銀處理的純棉無紡布。圖2 紅外光譜圖

2.2 聚多巴胺-納米銀抗菌性能研究

2.2.1 抑菌圈測試

圖3為純棉無紡布的抑菌圈測試圖。其中，D1、D2為僅經(jīng)過多巴胺處理的無紡布，A1、A2兩組為多巴胺和硝酸銀先后處理無紡布。

從圖3 A中觀察到，A1、A2兩塊樣品周圍有一個明顯的無菌圈，而空白和D1、D2三組樣品周圍均長滿了大腸桿菌，說明經(jīng)過多巴胺/硝酸銀處理的無紡布具有顯著的抗菌能力。觀察圖3 B可以得到相同的結(jié)論，并且在這個抑菌圈測試中，設(shè)置了3種不同濃度的多巴胺(A1=0.01、A2=0.02、A3=0.03 mol/L)，根據(jù)抑菌圈的大小，可以初步判定：在低濃度情況下，多巴胺濃度越大，多巴胺/硝酸銀處理無紡布的抑菌性越好。

A.大腸桿菌抑菌圈；B.金色葡萄球菌抑菌圈。圖3 抑菌圈測試圖

2.2.2 細菌生長曲線測試

1.3中五組測試樣品在36 h內(nèi)的不同時間點測試的OD600數(shù)據(jù)，繪制出細菌的生長曲線圖(圖4)，以分析菌液中細菌的實際生長情況。

由圖4可知，A2組試樣對大腸桿菌的抑制效果可長達36 h以上。LB初始平均值為0.201，菌液初始平均值為0.227。與菌液初始值相比，36 h后空白組的OD600值為2.807，增長了2.58；36 h后D2組的OD600值為2.219，增長了1.992；36 h后A2組的OD600值為0.270，僅增長了0.043，這充分證明了聚多巴胺-納米銀改性無紡布具有很好的抗菌性能，且抗菌持久。觀察三條曲線的走勢看到，空白組和D2組的走勢均先是快速增長，這是因為在堿性條件下，聚多巴胺中的酚羥基發(fā)生電離，粒子間存在靜電排斥作用，這種作用可以使納米銀顆粒更快分散從而不易團聚。

空白組為未經(jīng)任何處理的純棉無紡布；D1、D2為僅經(jīng)過多巴胺處理的無紡布；A1、A2為多巴胺和硝酸銀先后處理無紡布。圖4 細菌生長曲線圖

3 結(jié)論

通過多巴胺和硝酸銀溶液先后處理純棉無紡布得到抗菌無紡布，具有持久抗菌效果，抗菌時長至少可達36 h，可滿足一次性醫(yī)療口罩和防護衣的要求。研究發(fā)現(xiàn)，多巴胺首先經(jīng)過氧化聚合形成聚多巴胺，然后聚多巴胺將硝酸銀還原并與其結(jié)合形成聚多巴胺-納米銀，聚多巴胺通過醌基結(jié)構(gòu)與納米銀粒子進行相互作用。表征結(jié)果表明，納米銀通過聚多巴胺附著在無紡布表面，聚多巴胺包裹在納米銀表面，并且聚多巴胺-納米銀在體系中具有良好的分散性和穩(wěn)定性。聚多巴胺-納米銀粒子對大腸桿菌和金色葡萄球菌均具有優(yōu)良的抑制效果，并具有很好的耐洗牢度[8]。

當經(jīng)多巴胺和硝酸銀先后處理過的無紡布潤濕放入菌液后，Ag+和帶正電的納米銀被釋放出來，并通過庫侖力吸附在微生物的細胞膜上。由于銀離子具有很高的表面能和分散性，使得納米銀能夠與細胞膜表面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并破壞細胞膜的完整性，入侵細胞內(nèi)部。同時，因為Ag+能與細胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成沉淀，所以納米銀浸入細胞內(nèi)后會阻礙細胞正常的生理活動并最終使細胞失去分裂繁殖能力而失活[9]。