王 洹,姚 莎,何 蓉,陳 萌

(云南省化工研究院有限公司，云南 昆明 650228)

糞大腸菌群是反映堆肥在發(fā)酵過程中是否完全腐熟的指標(biāo)之一。目前在有機(jī)肥、有機(jī)-無機(jī)復(fù)混肥、生物有機(jī)肥、復(fù)合微生物肥料、農(nóng)用微生物菌劑等肥料檢測中，都會涉及到糞大腸菌群這個指標(biāo)。糞大腸菌群(Fecd Coliform)是總大腸菌群的一部分，主要來自糞便[1]，是一群在44.5±0.5 ℃ 的條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19524.1-2004《肥料中糞大腸菌群的測定》[2]中明確規(guī)定肥料中的糞大腸菌群最大可能數(shù)(MPN)要小于等于100。糞大腸菌群數(shù)的高低是衡量肥料腐熟程度的重要體現(xiàn)指標(biāo)，是堆肥能否有效殺死和消除肥料中所含的病原菌、寄生蟲卵等有害物質(zhì)[3]的依據(jù)。研究表明，施入農(nóng)田肥料帶入的糞大腸菌群，在土壤中可能會長期存活，并能進(jìn)入作物體內(nèi)，最終影響人體健康(尤其是老人和孩童)及農(nóng)業(yè)環(huán)境，嚴(yán)重污染可能會引起流行疾病的發(fā)生[4]。

本實(shí)驗(yàn)室在日常委檢樣品檢測-復(fù)檢的過程中發(fā)現(xiàn)，肥料中的糞大腸菌群數(shù)會隨著樣品儲存時(shí)間的加長出現(xiàn)下降的態(tài)勢。這與葉小梅[5]在畜禽糞便自然堆放及施入農(nóng)田后糞大腸菌群數(shù)量的消長研究結(jié)果相符(自然堆放的條件下，冬季和夏季糞便中糞大腸菌群數(shù)量在放置期間呈下降趨勢)。中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 525-2012《有機(jī)肥料》標(biāo)準(zhǔn)[6]中提到“經(jīng)四分法縮分后的樣品保存至少2個月，以備查用”，但在實(shí)際檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，保存1個月以后的樣品檢驗(yàn)結(jié)果有時(shí)會與第一次檢驗(yàn)的結(jié)果存在差異。為探究保存時(shí)間和保存條件對糞大腸菌群數(shù)指標(biāo)檢測結(jié)果的影響，進(jìn)一步確定肥料樣品最佳檢測時(shí)間，特設(shè)計(jì)如下試驗(yàn)方案，以期在肥料樣品檢測時(shí)效性方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

實(shí)驗(yàn)中所涉及的10份樣品，隨機(jī)取自日常委檢糞大腸菌群數(shù)指標(biāo)不合格的樣品。在無菌條件下將其分成兩等份，1份常溫保存，1份 4 ℃ 保存，每間隔一個月進(jìn)行一次糞大腸菌群檢測。

1.2 試劑

乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(生產(chǎn)批號：1075661)、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(生產(chǎn)批號：1065911)和革蘭氏染色液(生產(chǎn)批號：6105079)、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基(生產(chǎn)批號：1070521)，均購買自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

電子天平、試管、三角瓶、壓力蒸汽滅菌器、電熱鼓風(fēng)干燥箱、恒溫振蕩器、潔凈工作臺、滅菌槍頭、隔水式培養(yǎng)箱、顯微鏡、滅菌培養(yǎng)皿。

1.4 檢測流程

采用多管發(fā)酵法，按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T19524.1-2004《肥料中糞大腸菌群的測定》進(jìn)行試驗(yàn)，通過乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)、平板分離、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況，按陽性發(fā)酵管數(shù)查MPN表，確定每克(毫升)肥料樣品中的的糞大腸菌群數(shù)。

2 結(jié)果及分析

2.1 初始檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表1中統(tǒng)計(jì)了隨機(jī)抽取的10份糞大腸菌群數(shù)指標(biāo)不合格樣品糞大腸菌群數(shù)檢測結(jié)果。

由表1可知，10份隨機(jī)選出的肥料樣品，初始檢測結(jié)果顯示，糞大腸菌群數(shù)均>1100，遠(yuǎn)超于標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定限值(≤100)。這表明在肥料發(fā)酵腐熟過程中，糞大腸菌群沒有被殺死，這樣的肥料被農(nóng)戶施用到農(nóng)田中，其中的糞大腸菌群就會感染到農(nóng)作物上，影響農(nóng)產(chǎn)品，尤其是蔬菜的衛(wèi)生質(zhì)量，進(jìn)而影響人體健康。

表1 肥料鮮樣檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 儲存時(shí)間對檢測結(jié)果的影響

將10份樣品保存于常溫、4 ℃ 條件下1個月和2個月后，檢測糞大腸菌群指標(biāo)結(jié)果如表2。

由表2 可知，隨著肥料樣品儲存時(shí)間的增加，除樣品1和樣品7中的糞大腸菌群數(shù)未發(fā)生變化外，其余樣品均有明顯下降趨勢，其中的5份樣品在儲存2個月之后檢測結(jié)果發(fā)生顯著變化，產(chǎn)品質(zhì)量判定由不合格變成合格。初步推測糞大腸菌群數(shù)下降趨勢不一，可能與肥料的組成成分有關(guān)。有的基質(zhì)營養(yǎng)豐富，能較長時(shí)間為其中的糞大腸菌群提供生命物質(zhì)，所以試驗(yàn)結(jié)果沒有發(fā)生明顯變化；有的肥料樣品則變化巨大(不合格轉(zhuǎn)變成合格)，可能是因?yàn)樵摌悠分械木核锠I養(yǎng)物質(zhì)相對較少，或者是樣品的理化性質(zhì)發(fā)生改變，以及有機(jī)肥料自身繼續(xù)腐熟等情況，無法長期為糞大腸菌群提供生命物質(zhì)，導(dǎo)致菌群無法長期生存。

表2 不同保存條件下糞大腸菌群數(shù)對比

從表2中還可知，保存條件(常溫或 4 ℃)對樣品中的糞大腸菌群變化的影響明顯不同，絕大多數(shù)常溫儲存的樣品中糞大腸菌下降迅速，而低溫冷藏的樣品則能夠減緩糞大腸菌下降的速度，但不能完全抑制。原因可能是在常溫條件下菌群較為活躍，消耗營養(yǎng)物質(zhì)速度較快，保存時(shí)間較長，營養(yǎng)跟不上，導(dǎo)致菌群數(shù)下降迅速。而低溫保存的樣品菌群活躍度低，對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗相對較慢，因此菌群數(shù)下降速度減緩。但常溫保存和低溫保存都無法完全抑制菌群的生命活動，營養(yǎng)物質(zhì)持續(xù)減少，因此兩種保存條件下都無法完全抑制菌群數(shù)下降的趨勢。

從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，相較而言，肥料樣品在糞大腸菌群檢測期間最好能夠低溫冷藏儲存。同時(shí)，肥料樣品中的糞大腸菌群檢測具有時(shí)效性，在實(shí)際檢測中合理安排試驗(yàn)時(shí)間，新鮮的肥料來樣最好在極短的時(shí)間內(nèi)完成檢測，避免樣品自身屬性發(fā)生改變，致使結(jié)果發(fā)生偏差，不能反映有機(jī)肥料樣品的真實(shí)情況，無法給企業(yè)生產(chǎn)者提供有價(jià)值的參考。

2.3 兩種儲存條件下糞大腸菌群數(shù)量變化

由圖1和圖2可知，不論是常溫還是 4 ℃ 儲存，10份隨機(jī)選出的肥料樣品，隨著時(shí)間推移，80%的試樣中糞大腸菌群數(shù)量發(fā)生不同程度的下降，總體呈現(xiàn)出下降趨勢。間隔1個月復(fù)檢，4 ℃ 儲存的樣品中糞大腸菌群變化幅度明顯小于常溫儲存的，再次表明肥料樣品可短時(shí)間低溫冷藏待檢。間隔2個月以后再對樣品進(jìn)行復(fù)檢，發(fā)現(xiàn)兩種方式儲存的樣品中糞大腸菌群數(shù)變化非常大，不能重現(xiàn)初檢和第一次復(fù)檢的結(jié)果。

圖1 常溫條件下糞大腸菌群的變化

圖2 4 ℃條件下糞大腸菌群的變化

3 小結(jié)

研究發(fā)現(xiàn)，肥料中的糞大腸菌群數(shù)量隨著時(shí)間推移，大部分樣品呈現(xiàn)下降的趨勢。為了能夠客觀的評價(jià)肥料品質(zhì)，從生產(chǎn)企業(yè)送樣，到檢測機(jī)構(gòu)制樣、檢測，整個過程能快則快(建議一周之內(nèi)完成)。檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)可通過空白樣品及插入質(zhì)控樣品保證初檢結(jié)果的準(zhǔn)確性。若檢測機(jī)構(gòu)遇到間隔時(shí)間較長、需要復(fù)檢的有機(jī)肥料樣品時(shí)需特別注意。

研究還發(fā)現(xiàn)，跨時(shí)間段對肥料樣品中糞大腸菌群數(shù)進(jìn)行復(fù)檢，檢測結(jié)果不能復(fù)現(xiàn)，出具的復(fù)檢報(bào)告可能并不能真實(shí)反應(yīng)當(dāng)時(shí)有機(jī)肥料樣品的實(shí)際情況，提出復(fù)檢的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)嚴(yán)肅考慮產(chǎn)品的時(shí)效性，以避免對農(nóng)民造成損失。