李金祥，李佳歡，唐曉妍

(遼寧師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，遼寧 大連 116000)

高血壓是中老年人群中常見的慢性疾病，也是心腦血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。根據(jù)2012年世界衛(wèi)生組織報(bào)告，全世界四分之一的成年人即大約11.3億成年人患有高血壓，并且中風(fēng)和心臟病導(dǎo)致的死亡率為50%。因此，控制高血壓對(duì)于降低心血管疾病并發(fā)癥(如中風(fēng)、心臟驟停、冠心病、充血性心力衰竭等)至關(guān)重要。為了減少心血管疾病、并發(fā)癥并避免死亡，目標(biāo)是使患者的血壓低于 140/90 mmHg。

在高血壓的臨床治療中，單一用藥通常無法達(dá)到目標(biāo)血壓，而是需要兩種或多種藥物共同作用，將具有不同作用機(jī)制的降壓藥聯(lián)合使用有助于達(dá)到目標(biāo)血壓，同時(shí)這與單一藥物治療相比具有多個(gè)優(yōu)勢(shì)[1]。不同機(jī)制的藥物作用于人體，會(huì)使降壓效果更好，并改善治療的依從性。使用的劑量較低可以減少藥物的副作用，并且降低治療成本。

以往的文獻(xiàn)中報(bào)道了許多檢測(cè)體液中降壓藥含量的方法，如分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法、親水作用色譜法、毛細(xì)管電色譜法等，其中高效液相色譜法最為常用。Khuroo等[2]建立了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器(LC-MS)的方法用來同時(shí)檢測(cè)血漿中的阿替洛爾和氯噻酮的含量，該方法的靈敏度和特異性適合于阿替洛爾和氯噻酮的臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。Tabrizi等[3]利用熒光光譜法測(cè)定藥物制劑中的阿替洛爾和卡維地洛的含量。

但是并沒有查到利用微柱液相色譜同時(shí)分離和檢測(cè)氫氯噻嗪(HCT)、阿替洛爾(ATN)和利血平(RSP)三種降壓藥的方法。本研究建立了一種微柱液相色譜串聯(lián)紫外檢測(cè)器的方法用來同時(shí)分離和檢測(cè)血漿和尿液兩種基質(zhì)中HCT、ATN和RSP三種降壓藥。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器與試劑詳見表1、表2所示。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

表2 試劑與材料

1.2 色譜柱的制備

以 5 μm 裸硅球?yàn)檩d體，甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)為單體，季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)為交聯(lián)劑，甲醇與環(huán)己醇的混合溶液作為致孔劑，偶氮二異丁腈(AIBN)作為引發(fā)劑，在內(nèi)徑為 150 μm 的石英毛細(xì)管內(nèi)，以原位聚合的方式制備了硅膠顆粒擔(dān)載有機(jī)聚合物(GMA-co-PETA)的整體基質(zhì)。由于GMA本身帶有環(huán)氧活性基團(tuán)，使環(huán)氧活性基團(tuán)進(jìn)一步與亞硫酸鈉溶液進(jìn)行磺化反應(yīng)，使擔(dān)載基質(zhì)表面帶有磺酸根離子(SO32-)，即制得親水性強(qiáng)陽離子交換整體柱，而整體柱的親水性則表現(xiàn)在SO32-和含有親水性基團(tuán)-OH的交聯(lián)劑的使用。

1.3 生物樣品前處理

在分析生物樣品的過程中，對(duì)血漿和尿液等生物樣品的預(yù)處理非常重要，這可能直接影響分析的最終結(jié)果。目前生物樣品預(yù)處理方法包括液-液萃取[4]、固相萃取和蛋白質(zhì)沉淀法。本文采用對(duì)血漿和尿液進(jìn)行液-液萃取法以獲得較為純凈的基質(zhì)。

1.4 血漿樣品前處理

準(zhǔn)確移取 1 mL 血漿，向其中加入一定量HCT、ATN和RSP的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，使得樣品質(zhì)量濃度為 12 μg/mL。在 8000 r/min 下離心 5 min。離心后將淡黃色上層物質(zhì)轉(zhuǎn)移至另一干凈容器中，向其中加入 500 μL 乙酸乙酯，混合均勻后靜置 15 min, 將上層溶液取出并蒸干，殘余物質(zhì)用乙腈溶解，過濾后備用。

1.5 尿液樣品前處理

準(zhǔn)確移取 200 μL 尿液，向其中加入一定量HCT、ATN和RSP的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，使得樣品質(zhì)量濃度為 12 μg/mL。再向其中加入 1 mL 乙腈，混合均勻后在 8000 r/min 下離心 10 min，將上層清液轉(zhuǎn)移至另一干凈容器中，過濾備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離條件的優(yōu)化

利用親水性強(qiáng)陽離子整體柱分離HCT、ATN和RSP三種降壓藥的原理為:當(dāng)三種分析物在流動(dòng)相的作用下進(jìn)入色譜柱的過程中，三種分析物會(huì)發(fā)生不同程度的質(zhì)子化，并與固定相上SO32-產(chǎn)生靜電作用；根據(jù)三種分析物與固定相作用力和親水作用的不同從而實(shí)現(xiàn)分離。

為了獲得較好的分離效果，對(duì)流動(dòng)相的組成、濃度、pH及有機(jī)添加劑的含量等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。最后獲得的分離最佳條件為:以Na2HPO4作為流動(dòng)相，濃度為 50 mmol/L，pH=9.1，5%乙腈作為有機(jī)添加劑，在分離的最佳條件下獲得的色譜圖如圖1。

圖1 HCT、ATN和RSP對(duì)照品分離色譜圖

根據(jù)離子交換機(jī)理可以判斷分析物的出峰順序依次為HCT、ATN和RSP。因?yàn)樵诹鲃?dòng)相pH=9.1的實(shí)驗(yàn)條件下，HCT不發(fā)生質(zhì)子化，最先出峰，ATN和RSP發(fā)生質(zhì)子化，而RSP質(zhì)子化的程度更大即所帶正電荷更多，所以與固定相上負(fù)電荷之間的靜電作用更強(qiáng)，最后出峰。該出峰順序與單一對(duì)照品進(jìn)樣獲得的出峰順序一致。

2.2 血漿基質(zhì)中的分離

在最佳的分離條件下，將HCT、ATN和RSP三種降壓藥在血漿基質(zhì)中進(jìn)行分離，獲得的色譜圖如圖2。

圖2 血漿基質(zhì)中HCT、ATN和RSP分離色譜圖

對(duì)比圖1和圖2看出，血漿基質(zhì)對(duì)三種降壓藥的分離并不存在干擾。

2.3 尿液基質(zhì)中的分離

在最佳的分離條件下，將HCT、ATN和RSP三種降壓藥在尿液基質(zhì)中進(jìn)行分離，獲得的色譜圖3。

圖3 尿液基質(zhì)中HCT、ATN和RSP分離色譜圖

對(duì)比圖1和圖3看出，尿液基質(zhì)對(duì)三種降壓藥的分離并不存在干擾。

3 結(jié)論