鄭春連，黃勝銀，張迎春，羅景鵬，凌紹明

(百色學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣西 百色 533000)

丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化物代謝產(chǎn)生的一種物質(zhì)，該物質(zhì)具有很高的生物活性，能夠與DNA、蛋白酶、膜蛋白等結(jié)合，產(chǎn)生細(xì)胞毒害作用[1]。在研究動(dòng)植物的生理毒性時(shí)，通常以MDA的含量高低作為評價(jià)細(xì)胞膜系統(tǒng)受損害程度的重要指標(biāo)[2]。在糧油安全評價(jià)中，MDA是衡量食品或油脂脂質(zhì)過氧化程度的標(biāo)志物。研究表明，掛面、食用油、肉制品或腌制品中有MDA存在[3-5]，食用MDA含量高的食品會(huì)對人體多種器官產(chǎn)生危害。可見，建立一種準(zhǔn)確、快速測定MDA方法，對于快速判斷食品的品質(zhì)以及在研究動(dòng)植物體內(nèi)細(xì)胞膜系統(tǒng)損害程度和藥物(或毒物)的藥理(毒理)作用有重要的意義。目前，測定MDA的方法主要有高效液相色譜法[6-7]、液相色譜-質(zhì)譜法[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9]、分光光度法[10]、熒光法[11]和表面增強(qiáng)拉曼散射光譜法[12]等。色譜法檢出限低、靈敏度高，但是檢測成本高、操作繁瑣；表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢出限低、靈敏度高，但是SERS基底的穩(wěn)定性較差，重現(xiàn)性不好；分光光度法操作簡單，但靈敏度不高；共振散射光譜法是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種檢測速度快、靈敏度高的分析技術(shù)，在金屬離子、蛋白質(zhì)、核酸檢測上取得較好的效果[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，在pH 3.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，丙二醛(MDA)與2,4-二硝基苯肼(DNPH)發(fā)生反應(yīng)生成疏水性的苯腙，導(dǎo)致體系產(chǎn)生共振散射效應(yīng)，據(jù)此建立一種檢測MDA含量的共振散射光譜分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1.0 mg/mL 丙二醛(MDA)儲備液：用移液槍移取 231 μL 的1,1,3,3-四甲氧基丙烷溶于適量超純水，定容于 100 mL 棕色容量瓶中，4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?5 μg/mL 丙二醛標(biāo)準(zhǔn)工作液：用移液槍移取 2500 μL 1.0 mg/mL 丙二醛儲備液于 100 mL 棕色容量瓶，用超純水定容至刻度。2,4-二硝基苯肼(DNPH)稀乙醇溶液：在 15 mL 濃硫酸中，溶解 3.0 g 2,4-二硝基苯肼，另在 70 mL 95%乙醇中加入 20 mL 水，然后把硫酸苯肼倒入稀乙醇溶液中，混合均勻，如有沉淀過濾備用。不同pH值醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(BS)：由 0.10 mol/L 醋酸水溶液和 0.10 mol/L 醋酸鈉水溶液按一定比例混合而得。

F-7000型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；TST-UPB-20型超純水器，石家莊泰斯特儀器設(shè)備有限公司；AE240型電子分析天平，上海梅特勒-托利多有限公司；KG-200KDB型數(shù)控超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在5.0 mL具塞比色管中依次加入pH3.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液 450 μL、適量丙二醛標(biāo)準(zhǔn)工作液、2,4-二硝基苯肼稀乙醇溶液 500 μL，用水定容至 5.0 mL。在 50 ℃ 水浴中加熱 40 min，取出流水冷卻 3 min。用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行同步掃描(EX Slit=EM Slit=5.0 nm，PM Volt=500 V)得共振散射光譜圖。計(jì)算 438 nm 處的ΔI=I-I0。

2 結(jié)果與討論

2.1 共振散射光譜圖

1,1,3,3-四甲氧基丙烷在酸性條件下分解為MDA。由圖1可見，緩沖溶液-2,4-二硝基苯肼體系的共振散射強(qiáng)度較弱，當(dāng)有MDA存在時(shí)，MDA與2,4-二硝基苯肼發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成疏水性的苯腙，導(dǎo)致體系發(fā)生共振散射效應(yīng)，其中 451 nm、493 nm 處信號較強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)選擇 451 nm 處作為測量波長。

圖1 共振散射光譜圖

HAc-NaAc緩沖溶液(pH3.8)450 μL，2,4-二硝基苯肼乙醇溶液 500 μL，t=40 min，T=50 ℃。

2.2 檢測條件選擇

2.2.1 選擇緩沖溶液pH值及用量

實(shí)驗(yàn)考察不同緩沖溶液pH值(3.2、3.5、3.8、4.4、5.0、5.6)對ΔI的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：緩沖溶液pH值為3.8時(shí)，體系的ΔI較大而且穩(wěn)定，故實(shí)驗(yàn)取緩沖溶液pH值為3.8。按照實(shí)驗(yàn)方法考察緩沖溶液用量影響。結(jié)果顯示：隨著醋酸-醋酸鈉緩沖溶液用量增加，體系的ΔI逐漸加大，當(dāng)醋酸-醋酸鈉緩沖溶液用量為 450 μL 時(shí)體系的ΔI較大。實(shí)驗(yàn)選擇醋酸-醋酸鈉緩沖溶液用量為 450 μL。

2.2.2 選擇DNPH乙醇溶液用量

實(shí)驗(yàn)考察衍生化試劑DNPH乙醇溶液用量影響。結(jié)果顯示：隨著DNPH用量的增加，體系ΔI逐漸增大，當(dāng)DNPH用量大于 500 μL 時(shí)，ΔI隨著DNPH用量增加而迅速減少。這可能是增加DNPH用量，體系的空白值增大所致。實(shí)驗(yàn)選取DNPH用量為 500 μL。

2.2.3 選擇反應(yīng)時(shí)間

實(shí)驗(yàn)考察反應(yīng)時(shí)間對ΔI的影響。結(jié)果顯示：隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，體系ΔI增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于 40 min 時(shí)，體系的ΔI緩慢減少。實(shí)驗(yàn)選取反應(yīng)時(shí)間為 40 min。

2.2.4 選擇反應(yīng)溫度

實(shí)驗(yàn)考察反應(yīng)溫度對ΔI的影響。結(jié)果顯示：反應(yīng)溫度對體系的ΔI影響較為顯著。反應(yīng)溫度較低時(shí)，反應(yīng)速度慢，體系生成的苯腙微粒數(shù)量少，共振散射信號較弱；隨著反應(yīng)溫度的增大，反應(yīng)速度加快，體系生成的苯腙微粒數(shù)量增加，共振散射信號強(qiáng)度增強(qiáng)，ΔI逐漸增大；當(dāng)反應(yīng)溫度為 50 ℃ 時(shí)，ΔI達(dá)到最大值。反應(yīng)溫度大于 50 ℃ 以后，體系的ΔI逐漸減小，這可能是體系溫度較高時(shí)副反應(yīng)增多所致。

2.3 線性回歸方程與檢出限

移取0、15、50、75、150、200、300、500 μL MDA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2實(shí)驗(yàn)方法測定體系的共振散射強(qiáng)度I值，以ΔI為縱坐標(biāo)，MDA的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制方法的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。方法的線性回歸方程為ΔI=68.631+860.13ρ(ρ單位：μg/mL)，線性范圍為0.075～2.5 μg/mL，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9929，檢出限(3S/K)為 0.025 μg/mL。

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

2.5 樣品測定

按照文獻(xiàn)[15]的方法對樣品進(jìn)行處理。稱取大豆油或豬油各 100 g，加入三氯乙酸-EDTA混合溶液 100 mL(其中，三氯乙酸的質(zhì)量濃度為 75 g/L，EDTA的質(zhì)量濃度為 1.0 g/L)，攪拌 30 min，轉(zhuǎn)入分液漏斗進(jìn)行分離，將提取液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi),在 60 ℃ 左右旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至剩余的殘留液約為 50 mL 時(shí)停止蒸發(fā)，冷卻，將殘留物轉(zhuǎn)移到 100 mL 容量瓶，用超純水定容至刻度，4～6 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取約 10 mL 待測液過 0.45 μm 濾膜，再取適量濾液按照1.2實(shí)驗(yàn)方法測定MDA含量并做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 豬油、大豆油中MDA含量及加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=5)

由表1可見，本法的測定值與UV/VIS法[16](2010)的測定結(jié)果相吻合。

3 結(jié)論

在pH3.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，MDA與DNPH發(fā)生親核加成反應(yīng)生成疏水性的苯腙而導(dǎo)致體系的共振散射信號增強(qiáng)，其中 451 nm、493 nm 處信號較強(qiáng)(實(shí)驗(yàn)取 451 nm 為測定波長)，據(jù)此建立了一種共振散射光譜檢測MDA含量法，方法的線性回歸方程為ΔI=68.631+860.13ρ(ρ單位：μg/mL)，線性范圍為0.075～2.5 μg/mL，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9929，檢出限(3S/K)為 0.025 μg/mL。將本法應(yīng)用于豬油和大豆油中MDA含量測定，測定結(jié)果的RSD在2.3%～3.1%，回收率在97.2%～108%。