周亞麗，崔利華 ，陳建光，蔣志惠，王興云，薛玉旗，李翠華

（1.安陽工學院生物與食品工程學院，河南安陽 455000；2.安陽工學院食品檢測中心，河南安陽 455000；3.安陽工學院機械工程學院，河南安陽 455000）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld）是一種偽谷物，亦名藜谷、金谷子等，起源于安第斯地區(qū)，具有特征性的高遺傳變異性[1]。藜麥種類較多，顏色多達120多種，常見顏色有黑、白、紅三種顏色。不同顏色藜麥的營養(yǎng)、口感、形狀有差異[2]。藜麥營養(yǎng)豐富，含有膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)[3?5]和酚類化合物[6?7]。其中，酚類化合物可進一步分為多酚、類黃酮和皂苷等生物活性物質(zhì)[8]。酚類化合物具有很強的抗氧化活性，能夠清除自由基[9?10]，具有預防慢性疾?。òㄐ难芗膊　┌Y和糖尿?。┑淖饔肹11?15]。

皂苷，又叫角苷，味道苦澀，主要成分為糖基和皂苷元[9]，是藜麥種子中主要的抗氧化活性成分之一。成熟的藜麥種子皂苷含量約為20%～30%，籽粒種皮的皂苷含量占總皂苷的80%。皂苷大部分是由葡萄糖組成的三萜類皂苷，常見類型為齊墩果酸型、商陸酸型和常春藤等[16?17]。前人的研究發(fā)現(xiàn)，藜麥皂苷提取液中檢測出多種三萜類皂苷，且僅表現(xiàn)出三萜皂苷活性[18?19]。Madl等[20]從藜麥種子的三萜皂苷粗提物中分離出19種已報道的皂苷和68種新皂苷化合物。Yao等[21]研究發(fā)現(xiàn)藜麥中有11種皂苷和8種單體皂苷，而且發(fā)現(xiàn)其可作為消炎保健食品的功能性成分。杜靜婷等[22]在對藜麥糠皂苷的抗氧化活性的研究中發(fā)現(xiàn)，皂苷含量與抗氧化能力呈正相關性。此外，Han等[23]在對藜麥皂苷抗氧化性的研究中，使用ORAC（r=0.966）和FRAP分析法（r=0.925）也發(fā)現(xiàn)總皂苷含量與抗氧化活性具有顯著相關性（P<0.01）。因此，皂苷及其衍生物已在食品、醫(yī)藥、化妝品等眾多領域有廣泛應用。

目前關于皂苷的提取方法主要有回流法[24]、超聲波提取法[25]、微波輔助提取法[26]、CO2超臨界萃取法[27]和酶提取法[28]。回流萃取由于操作非常簡單、萃取率高、成本廉價常常被廣泛應用于天然成分的提取。由于皂苷分子結構復雜、極性大，所以目前常用的皂苷提取方法是溶劑提取。皂苷易吸潮，溶于水、熱甲醇和熱乙醇[29]，其中，甲醇以其低廉的價格和較高的提取率成為提取生物活性物質(zhì)最常用的溶劑。楊小梅等[30]分別用蒸餾水、正丁醇、無水甲醇、無水乙醇為提取劑，對荸薺中的皂苷進行提取，以甲醇為提取溶劑時，提取率最高（0.226%）；Han等[23]使用甲醇為提取劑，對藜麥種子中皂苷進行提取，提取量為15.50 mg OAE/g（OAE：齊墩果酸當量）。因此，本實驗以甲醇為提取試劑，使用加熱冷凝回流的方法對藜麥種子中總皂苷進行提取。

不同品種、不同顏色的藜麥種子中皂苷含量存在明顯差異[31]。趙亞東等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，紅色藜麥皂苷含量最高且抗氧化能力最強，白色藜麥皂苷含量最低且抗氧化能力最差。目前，國內(nèi)關于藜麥的研究多數(shù)集中在種植、營養(yǎng)價值、單一品種的藜麥皂苷提取和抗氧化研究，而關于不同顏色藜麥種子間皂苷含量和抗氧化性的差異研究未見報道。

本研究以帶皮的黑、白藜麥種子為試驗材料，使用加熱冷凝回流的方法，用甲醇溶液對藜麥種子中的皂苷進行提取，同時測定黑、白藜麥種子皂苷提取液還原（Fe3+）能力和清除 NO?2、·OH、DPPH·、的能力，分析黑、白藜麥種皮皂苷物質(zhì)的抗氧化活性，為藜麥產(chǎn)品的進一步有效開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山西藜麥 2019年購于寧夏香草生物技術有限公司，4 ℃保存；甲醇、齊墩果酸、香草醛、亞鐵氰化鉀、三氯化鐵溶液、1,1-二苯基-2-三硝基苯、N-1-萘基乙二胺鹽酸、鄰苯三酚、水楊酸、亞硝酸鈉、三羥甲基氨基甲烷等試劑 以上試劑均為分析純，購于天津市科密歐化學試劑有限公司。

FW-2粉碎機 浙江武義屹立工具有限公司；RE-5203旋轉蒸發(fā)儀 鄭州貝楷儀器設備有限公司；H1850離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；T9紫外光可見光分光光度計 北京普析通用有限公司；ME204E分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藜麥皂苷的提取 選用新鮮且飽滿的山西藜麥種子為原料，除雜后采用粉碎機制粉，粉碎后用80目的篩子篩分后得藜麥粉末，將藜麥粉末通過索氏抽提法脫脂為預處理藜麥粉末，干燥避光保存。藜麥皂苷的提取參考Alvarez-Jubete等[11]的方法，并稍作修改。將甲醇與預處理藜麥粉1:40（g/mL）充分混合，提取溫度為60 ℃，進行連續(xù)加熱回流4 h后，避光過濾。然后將50 g藜麥提取液回收合并至旋轉蒸發(fā)瓶，在45 ℃條件下旋轉蒸發(fā)進行皂苷富集。最后用30 mL超純水溶解，得到的皂苷樣品溶液避光保存。

1.2.2 藜麥皂苷含量測定和標準曲線的繪制 準備吸取皂苷樣品溶液1 mL于離心管中，加入0.2 mL香草醛-冰乙酸溶液、0.8 mL高氯酸，60 ℃水浴15 min，迅速冷卻，加入4.0 mL乙酸乙酯，避光靜置20 min，取出，于550 nm處測定吸光度。根據(jù)回歸方程計算藜麥皂苷濃度C，根據(jù)下公式計算藜麥皂苷含量。

式中：Q為皂苷含量（mg/g）；C為皂苷濃度（mg/mL）；V為提取液的總體積（mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。

標準曲線的繪制參考徐曉敏[32]的方法：準確稱取齊墩果酸標準品0.01058 g于容量瓶中，加甲醇適量溶解，定容至100 mL，即得100 μg/mL的標準溶液。精確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的100 μg/mL的齊墩果酸標準溶液，70 ℃水浴揮去甲醇后用冷水冷卻。吸取0.2 mL 5%（w/v）香草醛-冰乙酸溶液、0.8 mL高氯酸，60 ℃水浴15 min，迅速冷卻，吸取4.0 mL乙酸乙酯，避光20 min反應，于550 nm處測其吸光值，每組三個平行試驗。最后，以吸光度為x軸，以標準品質(zhì)量濃度（mg/mL）為y軸繪制標準曲線，繪制回歸方程y=104.28x?0.1432，R2=0.9998。

1.2.3 藜麥皂苷抗氧化性的測定 藜麥體外抗氧化試驗主要通過測定Fe3+、N O?2、·OH、DPPH·、五個指標確定藜麥種子皂苷的抗氧化活性，將提取的黑、白藜麥種子總皂苷提取液分別稀釋成不同濃度進行測定，以同等濃度的VC作為黑、白藜麥的陽性對照，分析兩種不同顏色藜麥總皂苷的抗氧化性。IC50值是指能夠清除一半自由基的藜麥皂苷提取物的最低濃度（mg/mL）。

1.2.3.1 還原（Fe3+）能力的測定 采用鐵氰化鉀法[11]測定皂苷還原Fe3+能力，以生成的普魯士藍作為測定指標，顏色越深，生成的量就越多，吸光度越大，還原Fe3+能力越強。將藜麥和抗壞血酸配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，具體操作方法如下，結果以吸光度表示。

還原（Fe3+）能力的測定方法：吸取不同質(zhì)量濃度的樣品/VC1 mL，0.2 mol/L pH6.6磷酸鹽溶液2.5 mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，充分搖勻，50 ℃條件下水浴20 min，冷卻后，加入10%三氯乙酸2.5 mL，3000×g離心10 min，取2 mL上清，加超純水2.5 mL，加0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，靜置10 min，于700 nm處測定其吸光值。

1.2.3.2 對DPPH·清除能力的測定 根據(jù)Hirose等[33]的方法并稍作修改，該方法利用穩(wěn)定的1,1-二苯基-2-三硝基苯（DPPH）自由基，測定樣品消除DPPH·的能力。將藜麥和抗壞血酸配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，具體操作方法如下。

DPPH·清除率的測定方法：樣品組/VC組，吸取不同質(zhì)量濃度的樣品/VC2 mL，0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液2 mL；空白組，吸取0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液2 mL，超純水2 mL；干擾組，吸取不同質(zhì)量濃度的樣品/VC2 mL，無水乙醇2 mL。避光反應15 min，于517 nm處測定其吸光值，樣品組/VC組吸光值記為A1，空白組吸光值為A0，干擾組吸光值記為A2。

DPPH·清除率計算公式：P（%）=[1?(A1?A2)/A0]×100；

式中：P為自由基清除率（%）；A0為空白對照組；A1為樣品/VC試驗組；A2為干擾試驗組。

式中：△A0為鄰苯三酚的自氧化速率；△A1為加入樣品的反應溶液吸光值的變化率。

1.2.3.4 對·OH清除能力的測定 ·OH自由基的清除能力測定參考Smirnoff等[34]的方法，并稍加修改。將藜麥和抗壞血酸配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，具體操作方法如下。

·OH清除率的測定方法：樣品組/VC組，吸取不同質(zhì)量濃度的樣品/VC1 mL；空白組，吸取超純水1 mL；干擾組，吸取不同質(zhì)量濃度的樣品/VC1 mL。分別向三組加入6 mmol/L硫酸亞鐵溶液2 mL，6 mmol/水楊酸-乙醇溶2 mL，6 mmol/L H2O22 mL，充分振蕩搖勻后，避光反應30 min，510 nm處測定其吸光值，樣品組/VC組吸光值記為A1，空白組吸光值記為A0，干擾組吸光值記為A2。

·OH清除率計算公式：P（%）=[1?(A1?A2)/A0]×100；

式中：P為自由基清除率（%）；A0為空白對照組；A1為樣品/VC試驗組；A2為干擾試驗組。

1.2.3.5 對N O?2清除能力的測定 N O?2的清除能力測定參考Hirose等[33]的方法，并稍作修改。將藜麥和抗壞血酸配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，具體操作方法如下。

NO?2清除率的測定方法：樣品組/VC組，吸取不同質(zhì)量濃度的樣品/VC1 mL，5.0 μg/mL NaNO22 mL；空白組：吸取超純水1 mL，5.0 μg/mL NaNO22 mL；干擾組：吸取不同質(zhì)量濃度的樣品/VC1 mL，超純水2 mL。25 ℃條件下避光反應30 min，分別加入4 g/L對氨基苯磺酸2 mL，振蕩混勻，25 ℃條件下，避光，靜置5 min，分別加入2 g/L N-1-萘基乙二胺鹽酸1 mL，蒸餾水定容至10 mL，25 ℃下反應15 min，于538 nm處測定其吸光值，樣品組/VC組吸光值記為A1，空白組吸光值記為A0，干擾組吸光值記為A2。

NO?2清除率計算公式：P（%）=[1?(A1?A2)/A0]×100；

式中：P為清除率（%）；A0為空白對照組；A1為樣品/VC試驗組；A2為干擾試驗組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗所得的數(shù)據(jù)使用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 17.0軟件分別進行數(shù)據(jù)計算和顯著性分析（P<0.05），使用Origin 2016軟件繪圖。所有的數(shù)據(jù)均為三個重復的平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 黑、白藜麥皂苷含量對比

通過測定黑、白藜麥總皂苷提取液吸光值，根據(jù)1.2.2中回歸方程及皂苷含量計算公式，計算兩種不同顏色的藜麥皂苷含量。結果顯示，黑藜麥種子皂苷含量為（17.37±0.85） mg/g；白藜麥種子皂苷含量為（1.89±0.01） mg/g；相同質(zhì)量的藜麥，黑藜麥種子皂苷含量遠高于白藜麥。兩種不同顏色的藜麥總皂苷含量存在差異，可能是由于藜麥的品種、遺傳因素、農(nóng)業(yè)技術及環(huán)境條件的不同導致的總皂苷含量不同，這與前人的研究結果一致[23,31]。

2.2 黑、白藜麥皂苷抗氧化能力的測定結果

2.2.1 黑、白藜麥皂苷的還原（Fe3+）力 從圖1可知，吸光度越大，說明藜麥種子皂苷的還原能力越強，即抗氧化性越強；黑、白藜麥種子皂苷的還原能力與質(zhì)量濃度呈正相關。隨著皂苷質(zhì)量濃度的增大，吸光度增大，皂苷的還原能力增強；相同質(zhì)量濃度下，黑藜麥種子皂苷的還原能力高于白藜麥，在2.5 mg/mL時，達到最大值，吸光度分別為0.958±0.003和0.500±0.001，說明藜麥皂苷具有較強的還原力。與陽性對照VC相比，黑、白藜麥種子中皂苷的還原能力均弱于VC。由表1可知，與VC的IC50值（61.953 mg/mL）相比，黑、白藜麥種子皂苷均表現(xiàn)較高的IC50值，但黑藜麥種子皂苷IC50值（139.989 mg/mL）顯著低于白藜麥種子皂苷的IC50值（265.475 mg/mL）。Chen等[35]的研究結果表明，藜麥葉片提取液具有很強的清除鐵離子等自由基的能力，并且隨著提取液濃度的增大，清除能力增強，本研究結果與其一致。

圖1 藜麥種子皂苷還原Fe3+能力Fig.1 Fe3+ reducing power of saponins from quinoa seeds

表1 藜麥種子皂苷還原Fe3+能力的IC50值Table 1 The IC50 value of Fe3+ reducing power of saponins from quinoa seeds

2.2.2 黑、白藜麥皂苷清除DPPH·能力 由圖2可知，黑、白藜麥種子皂苷對DPPH·具有很強的清除能力。隨著皂苷濃度的增大，黑、白藜麥種子皂苷對DPPH·的清除能力逐漸增強，說明皂苷的質(zhì)量濃度直接影響藜麥的抗氧化能力，這與Tang等[14]的研究結果一致。當濃度達到0.5 mg/mL時，黑藜麥種子皂苷的清除率達到91.34%，白藜麥種子的清除率為72.00%。與陽性對照VC（IC50值0.070 mg/mL）相比，黑、白藜麥種子中皂苷對DPPH·清除率弱于VC。由表2可知，白藜麥種子皂苷的IC50值（0.210 mg/mL）顯著高于黑藜麥種子皂苷的IC50值（0.122 mg/mL），說明黑藜麥種子皂苷具有較強的清除能力，這與前人的研究結果一致[23,36?37]。

圖2 藜麥種子皂苷清除DPPH·能力Fig.2 DPPH· scavenging activity of saponins from quinoa seeds

表2 藜麥種子皂苷清除DPPH·能力的IC50值Table 2 The IC50 value of DPPH· scavenging activity of saponins from quinoa seeds

2.2.3 黑、白藜麥皂苷清除O?2·能力 由圖3可知，隨著藜麥種子皂苷質(zhì)量濃度的增大，黑、白藜麥種子皂苷對 O?2·的清除能力增強。當總皂苷濃度達到2.5 mg/mL時，黑藜麥種子皂苷對 O?2·的清除率為80.39%，白藜麥種子皂苷對O?2·的清除率為26.80%，均低于VC對O?2·的清除率（98.15%）。黑藜麥種子皂苷對O?2·的清除能力高于白藜麥，同時，由表3可知，黑藜麥種子皂苷清除O?2·的IC50值（1.106 mg/mL）顯著低于白藜麥種子皂苷清除O?2·的IC50值（5.530 mg/mL），這與Rocchetti等[38]報道的紅色和黑色藜麥粉具有較強的清除氧自由基能力的結果一致，但黑、白藜麥種子皂苷清除O?2·的能力均弱于VC（IC50值0.234 mg/mL）。

圖3 藜麥種子皂苷清除O ?2·能力Fig.3 O ?2· scavenging activity of saponins from quinoa seeds

表3 藜麥種子皂苷清除O ?2·能力的IC50值Table 3 The IC50 value of O ?2· scavenging activity of saponins from quinoa seeds

2.2.4 黑、白藜麥皂苷清除·OH能力 由圖4可知，隨著藜麥種子皂苷質(zhì)量濃度的增大，黑、白藜麥種子皂苷對·OH的清除能力逐漸增強；但黑藜麥種子皂苷對·OH的清除能力高于白藜麥。在試驗濃度內(nèi)，兩種藜麥種子皂苷對·OH的清除能力與皂苷的質(zhì)量濃度呈正相關關系，這與前人的研究結果一致[39?40]。當濃度為2.5 mg/mL時，黑藜麥種子皂苷對·OH的清除率（95.00%）與VC（清除率98.70%）對·OH的清除能力相近，白藜麥種子皂苷對·OH的清除率為52.00%。由表4可知，與VC清除·OH的IC50值（0.511 mg/mL）相比，白藜麥種子皂苷清除·OH的IC50值顯著高于VC清除·OH的IC50值，黑藜麥種子皂苷清除·OH的IC50值（0.514 mg/mL）與VC清除·OH的IC50值無顯著性差異，但黑藜麥種子皂苷清除·OH的IC50值顯著低于白藜麥種子皂苷清除·OH的IC50值（2.500 mg/mL），說明黑藜麥種子皂苷對·OH的清除能力高于白藜麥種子皂苷。

圖4 藜麥種子皂苷清除?OH能力Fig.4 ·OH scavenging activity of saponins from quinoa seeds

表4 藜麥種子皂苷清除·OH能力的IC50值Table 4 The IC50 value of ·OH scavenging activity of saponins from quinoa seeds

2.2.5 黑、白藜麥皂苷清除N O?2能力 由圖5可知，隨著藜麥種子皂苷質(zhì)量濃度的增大，黑藜麥種子皂苷對 NO?2的清除能力逐漸增強。當質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時，黑藜麥種子皂苷對N O?2的清除率為58.76%，高于白藜麥種子皂苷對 NO?2的清除率（39.50%），但低于VC對N O?2的清除率（88.74%）。在試驗濃度范圍內(nèi)，白藜麥種子總皂苷對N O?2的清除能力極弱。由表5可知，與陽性對照VC清除 NO?2的IC50值（0.473 mg/mL）相比，黑、白兩種藜麥種子皂苷對N O?2的清除能力均低于VC，但黑藜麥種子皂苷清除N O?2的IC50值（0.832 mg/mL）顯著低于白藜麥種子皂苷（1.569 mg/mL），即黑藜麥種子皂苷具有較強的清除N O?2的能力。

圖5 藜麥種子皂苷清除NO?2能力Fig.5 N O?2 scavenging activity of saponins from quinoa seeds

表5 藜麥種子皂苷清除N O?2能力的IC50值Table 5 The IC50 valueofNO?2scavenging activity of saponins fromquinoaseeds

3 結論

通過對比黑、白藜麥種子中皂苷含量和抗氧化能力，得出黑藜麥種子中皂苷的含量（17.37 mg/g）遠高于白藜麥（1.89 mg/g）。兩種不同顏色的藜麥種子中皂苷都具有較強的還原能力和清除DPPH·、·OH、的能力，并且隨著藜麥種子皂苷質(zhì)量濃度的增加，還原能力和抗氧化能力逐漸增強，但同等濃度條件下，黑藜麥種子中皂苷的抗氧化能力高于白藜麥種子皂苷，但均低于VC。當皂苷質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，黑藜麥種子中皂苷對DPPH·的清除率達到91.34%，白藜麥種子中皂苷對DPPH·的清除率為72.00%；當皂苷質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，黑藜麥種子中皂苷對的清除率為80.39%，白藜麥種子中皂苷對的清除率為26.80%，黑藜麥種子中皂苷對·OH的清除率為95.00%，白藜麥種子中皂苷對·OH的清除率為52.00%；在試驗濃度范圍內(nèi)，白藜麥種子中皂苷對N O?2的清除能力較弱?？傮w來看，與白藜麥相比，黑藜麥種子皂苷含量和抗氧化能力均較強，本研究為進一步有效開發(fā)藜麥產(chǎn)品，提供了理論依據(jù)。