徐飛飛，田雅娟，李欽青，楚世峰，賀文彬,

（1.山西中醫(yī)藥大學, 中醫(yī)腦病學山西省重點實驗室，山西太原 030024；2.中國醫(yī)學科學院藥物研究所，北京 100050）

失眠，指人們在日常生活中表現(xiàn)出入睡困難，睡眠時間不足等現(xiàn)象的一種慢性疾病[1]。隨著國民生活節(jié)奏的不斷加快，以及工作壓力的增加，失眠人群比例逐年升高[2,3]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）調查顯示，全球范圍內約有三分之一的人存在失眠癥狀或睡眠功能障礙[4]?！?019年中國睡眠指數(shù)報告》指出，約50%的國民有嚴重的睡眠問題，失眠已經成為人們日常生活中面臨的主要難題之一[5]。研究發(fā)現(xiàn)，失眠能夠造成記憶力減退，注意力不集中等日?，F(xiàn)象，會對大腦造成不可逆的損傷，并且它是各類心腦血管疾病、神經退行性疾病的并發(fā)癥[6]。

現(xiàn)代醫(yī)學研究認為，改善睡眠的機制主要與調節(jié)血清素（即5-羥色胺，5-hydroxytryptamine，5- HT）系統(tǒng)、谷氨酸（glutamate，Glu）與γ-氨基丁酸（γaminobu-tyric acid，GABA）的平衡有關[7?7]。目前，治療失眠的藥物主要包括安定類藥物（苯二氮卓類藥物）、抗抑郁藥或抗精神病類的藥物等，由于失眠的治療難度大，用藥周期長，會出現(xiàn)藥物依賴和反跳等副作用[7]。失眠是多因素誘導的慢性疾病，而單靶點研究會產生一定的局限性，傳統(tǒng)中草藥具有多成分、多靶點的特點，能夠通過多種途徑起到有效改善作用，在疾病的預防、治療、康復中發(fā)揮了獨特優(yōu)勢[8]。

中醫(yī)稱失眠為“不寐”，認為失眠是由臟腑失和、氣血失調所致心神失養(yǎng)、心神不安的一類疾病[9]。酸棗仁湯是傳統(tǒng)中醫(yī)用以治療失眠的方劑，東漢張仲景在《金匱要略》“血痹虛勞病篇”中記載“虛煩虛勞不得眠，酸棗仁湯主之”[10]。酸棗仁為方中主藥，具有養(yǎng)血柔肝、寧心安神的功效。通過“中醫(yī)傳承輔助平臺”系統(tǒng)軟件數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，酸棗仁是治療失眠最常用的單味藥及復方配伍中藥[11]。酸棗仁總皂苷及生物堿能夠調節(jié)大腦皮質及海馬中Glu、GABA以及5-HT含量[12,13]；黃酮苷類活性成分斯皮諾素能夠延長睡眠時間[14]；以酸棗仁配伍而成的復方及藥對，也能夠發(fā)揮顯著的鎮(zhèn)靜催眠作用[15,16]。酸棗仁湯中茯苓的有效成分茯苓多糖對睡眠具有良好的調節(jié)作用，基于茯苓化濕健脾功效，臨床常將其用于治療心脾兩虛造成的失眠[17,18]。失眠人群常伴隨免疫力低下、神經衰弱、記憶力減退等癥狀[19,20]。研究表明，藥食兩用藥材黨參能夠補氣健脾，改善四肢無力、心悸等癥，在提高機體免疫力、學習記憶能力以及安神益智等方面具有顯著作用[21]。

本研究將酸棗仁、茯苓、黨參三味“藥食同源”中藥材配伍，通過戊巴比妥鈉誘導的催眠模型以及對氯苯丙氨酸建立的睡眠剝奪模型，評價不同濃度酸棗仁-茯苓-黨參水提物對失眠小鼠的改善作用。分別檢測小鼠下丘腦、皮層中血清素系統(tǒng)5-HT及色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）的含量；海馬、皮層中Glu及GABA的含量，探討相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性健康昆明（KM）小鼠 SPF級，120只，體重（25±3） g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0006；炒酸棗仁、黨參

購自安國市遠光藥業(yè)有限公司；茯苓 購自山西元和堂中藥有限公司；地西泮片 山東信誼制藥有限公司；戊巴比妥鈉 德國Merck公司；對氯苯丙氨酸（PCPA） 美國 Sigma 公司；5-HT、TPH、Glu、GABA試劑盒 上?？ㄅ锟萍加邢薰尽?/p>

Heraeus Multifuge X1R型高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴 金壇市盛威實驗儀器公司；VERSA max-BNRO5709型酶標儀 上海美谷分子儀器有限公司；R540增強型動物麻醉機 深圳市瑞沃德生命科技有限公司；DZBS-50型制冰機 江蘇白雪電器股份有限公司；XRXZ301型小鼠曠場及分析系統(tǒng) 上海欣軟信息科技有限公司；Milli-Q Advantage A10型超純水儀 默克化工技術（上海）有限公司；THZ-92B型氣浴恒溫箱 上海博訊實業(yè)有限公司；EX125DZH型電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸棗仁-茯苓-黨參水提物制備 取炒酸棗仁粗粉、茯苓粗粉、黨參粗粉各100 g（質量比1:1:1），加10倍量的水浸泡1 h，煎煮1.5 h。紗布過濾，藥液備用，藥渣加8倍量水煎煮1 h。過濾，合并兩次濾液，常壓濃縮至1 mL藥液相當于原藥材1 g。對于小鼠實驗研究，均以人體推薦劑量10倍左右為標準設定低、中、高劑量，故本實驗以10、20、40倍人體劑量作用于小鼠[22?23]。灌胃劑量為10 mL/（kg·d）。則取14 mL水煎液加86 mL水，濃度即為100 mL含14 g原藥材；取28 mL水煎液加72 mL水，濃度即為100 mL含28 g原藥材；取56 mL水煎液加44 mL水，濃度即為100 mL含56 g原藥材，可得酸棗仁-茯苓-黨參低、中、高劑量為14、28、56 g/kg，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 實驗動物分組 小鼠于試驗前7 d置于實驗室適應環(huán)境，室溫（23±2） ℃，相對濕度50%～60%，12/12 h明暗交替，自由飲食、攝水。120只KM小鼠中隨機選取60只進行自主活動實驗和戊巴比妥鈉誘導睡眠實驗，為行為學A實驗。另外60只小鼠進行對氯苯丙氨酸誘導失眠實驗，為行為學B實驗。行為學A實驗動物分組為：正常組，溶劑對照組（戊巴比妥鈉，45 mg/kg），酸棗仁-茯苓-黨參低、中、高劑量組（14、28、56 g/kg），陽性藥組（地西泮，2.5 mg/kg）；行為學B實驗動物分組為：正常組，模型組（PCPA，300 mg/kg），酸棗仁-茯苓-黨參低、中、高劑量組，陽性藥組，每組10只，灌胃劑量為10 mL/（kg·d），不間斷給藥30 d。

1.2.3 行為學評價方法

1.2.3.1 酸棗仁-茯苓-黨參水提物對正常小鼠自主活動的影響 選取“1.2.2”中行為學A實驗正常組，酸棗仁-茯苓-黨參低、中、高劑量組，陽性藥組小鼠，于給藥前一天（第0 d）進行首次曠場實驗，評價小鼠自主活動組間差異。用SuperMaze動物行為學視頻分析軟件將敞箱平均分為九格，小鼠每穿過一格記為一分，即水平得分。將各組小鼠依次置于敞箱內，適應2 min后記錄小鼠在5 min內的活動情況，小鼠活動距離及水平得分。用75%酒精對敞箱進行擦拭，除去上一只小鼠的氣味與糞便，再將下一只小鼠放入。視頻內容由SuperMaze動物行為學視頻分析軟件V2.0版分析。

于給藥第29 d各組小鼠灌胃給藥30 min后進行第二次曠場實驗。綜合兩次曠場實驗結果，分析正常組、酸棗仁-茯苓-黨參低、中、高劑量組、陽性藥組小鼠水平得分與活動距離，評價不同濃度酸棗仁-茯苓-黨參水提物對正常小鼠的影響。

1.2.3.2 戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠實驗 選取“1.2.2”中行為學A實驗溶劑對照組、酸棗仁-茯苓-黨參低、中、高劑量組、陽性藥組小鼠，于第30 d末次灌胃給藥30 min后，均腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）建立睡眠模型。在戊巴比妥鈉誘導下，小鼠進入睡眠，翻正反射消失1 min以上即認定動物進入睡眠狀態(tài)。將腹腔注射至翻正反射消失的總時間認定為睡眠潛伏期。將翻正反射消失至小鼠恢復翻正的總時間認定為睡眠時間。觀察溶劑對照組、酸棗仁-茯苓-黨參組以及陽性藥組小鼠翻正反射消失與恢復的時間。

1.2.3.3 對氯苯丙氨酸（PCPA）誘導小鼠失眠實驗選取“1.2.2”中行為學B實驗正常組，模型組（失眠模型），低、中、高劑量酸棗仁-茯苓-黨參組，陽性藥組小鼠，于第27 d和第28 d的9:00灌胃給藥30 min后，正常組腹腔注射生理鹽水，模型組、酸棗仁-茯苓-黨參低、中、高劑量組、陽性藥組均腹腔注射PCPA建立小鼠睡眠剝奪模型，劑量為300 mg/kg。連續(xù)兩天觀察模型組小鼠體重、毛發(fā)與攻擊性，若體重降低、毛發(fā)無光澤且攻擊性強，則判斷失眠模型建立成功。于第30 d各組小鼠末次灌胃給藥30 min后進行曠場實驗，記錄小鼠水平得分及活動距離。

1.2.4 酶聯(lián)免疫法檢測小鼠腦組織神經遞質及酶含量

1.2.4.1 檢測小鼠腦組織血清素系統(tǒng)變化 選取“1.2.3.3”中60只小鼠，異氟烷麻醉，記錄體重。脫頸椎處死小鼠，迅速于冰上斷頭取腦，用生理鹽水沖掉血液，濾紙擦干后稱重。取下丘腦、皮層、海馬，分別加9倍量的4 ℃生理鹽水，冰浴手動均漿，移至離心管中離心（3 000 r/min，15 min，4 ℃），取上清液分裝，置于?20 ℃保存?zhèn)溆?。照試劑盒相關操作步驟得到標準曲線，將測定樣品中5-HT、TPH的OD值帶入，分別計算小鼠下丘腦、皮層組織中5-HT、TPH的含量。

1.2.4.2 檢測小鼠腦組織興奮-抑制性神經遞質變化 照試劑盒相關操作步驟得到標準曲線，將測定樣品中Glu、GABA的OD值帶入，分別計算小鼠海馬、皮層組織中Glu、GABA的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結果均為計量資料，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，采用GraphPad Prism 6.02統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠行為學的影響

2.1.1 對正常小鼠自主活動的影響 在改善睡眠的藥物研究中，行為學作為初步判斷指標，是后期進行機制研究重要的前提與基礎[24]。自主活動能夠反映藥物對受試對象行為表現(xiàn)是否產生影響，曠場實驗是評價動物自主活動應用最廣泛的一種測試方法[25,26]。本研究結合鄭竹宏等[27]及梁宇等[25]的自主活動評價方法，選擇水平得分和活動距離兩項指標分析酸棗仁-茯苓-黨參水提物對正常小鼠自主活動的影響，首次（第0 d）曠場實驗與第29 d曠場實驗指標結果見表1。

表1 酸棗仁-茯苓-黨參水提物對正常小鼠自主活動的影響（n=10）Table 1 Effects of Ziziphi Spinosae Semen, Poria Cocos and Codonopsis Radix on the autonomic activity of normal mouse (n=10)

由表1可得，正常組，酸棗仁-茯苓-黨參組，陽性藥組小鼠在第0 d水平得分與活動距離無明顯差別，說明各組小鼠間無顯著差異，后續(xù)曠場實驗有統(tǒng)計分析意義。研究認為鎮(zhèn)靜促眠類藥物作用于正常小鼠后會降低小鼠自主活動能力[28]，與第0 d相比，第29 d酸棗仁-茯苓-黨參組小鼠水平得分與活動距離均降低，自主活動能力明顯下降，表明酸棗仁-茯苓-黨參水提物能夠降低正常小鼠興奮性，對正常小鼠起到一定的鎮(zhèn)靜作用。其中酸棗仁-茯苓-黨參高劑量組水平得分與正常組相比顯著降低（P<0.05）；酸棗仁-茯苓-黨參中劑量與高劑量組活動距離與正常組相比顯著降低（P<0.05）。

2.1.2 對小鼠睡眠潛伏期及睡眠時間的影響 戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠實驗是評價改善睡眠藥物研究中必不可少的行為學實驗[29]。本研究通過前期預實驗，在小鼠不死亡并且能夠進入睡眠狀態(tài)的前提下，選擇與俞盈等[30]研究相近得戊巴比妥鈉注射劑量（45 mg/kg），酸棗仁-茯苓-黨參水提物對戊巴比妥鈉誘導的催眠小鼠的影響見表2。

表2 酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠睡眠潛伏期及睡眠時間的影響（n=10）Table 2 Effects of Ziziphi Spinosae Semen, Poria Cocos and Codonopsis Radix on the sleep latency and sleep duration of mice (n=10)

結果表明，與溶劑對照組比較，酸棗仁-茯苓-黨參中劑量與高劑量組小鼠的睡眠潛伏期均顯著減少（P<0.05,P<0.01），表明酸棗仁-茯苓-黨參水提物能夠促進小鼠入眠；此外，在戊巴比妥鈉催眠的基礎上，若睡眠時間延長，也能夠說明藥物有促進睡眠作用[31]。酸棗仁-茯苓-黨參水提物低、中、高劑量均能顯著增加溶劑對照組小鼠睡眠時間（P<0.05,P<0.01），各劑量組間存在量效關系，該結果說明酸棗仁-茯苓-黨參水提物能夠延長小鼠的睡眠時間，對睡眠具有改善作用。

2.1.3 對PCPA誘導的失眠模型小鼠自主活動的影響 PCPA誘導的失眠模型小鼠，應觀察模型組小鼠得體重變化、毛發(fā)色澤與攻擊性，簡單判斷模型是否建立成功[32]。本研究于第27、28 d腹腔注射PCPA后，發(fā)現(xiàn)與正常組小鼠相比，模型組小鼠體重降低、毛發(fā)無光澤且凌亂、攻擊性強，則初步判斷失眠模型建立成功。第30 d進行曠場實驗，評價指標與“2.2.1”相同，圖1（A， B）為酸棗仁-茯苓-黨參水提物對PCPA誘導的失眠小鼠自主活動的影響。

圖1A結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠水平得分（120.20±22.46）顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，酸棗仁-茯苓-黨參高劑量組（81.33±20.67）顯著降低（P<0.05），且具有統(tǒng)計學意義。圖1B結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠活動距離（45.39±6.846）顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，酸棗仁-茯苓-黨參中劑量（32.74±7.452）與高劑量組（31.73±5.759）顯著減少，且具有統(tǒng)計學意義（P<0.05；P<0.01）。結果表明，酸棗仁-茯苓-黨參低、中、高劑量對失眠小鼠水平得分與活動距離均表現(xiàn)出改善作用，只有高劑量組有顯著差異（P<0.05，P<0.01）。焦富英等[33]在研究中認為自主活動指標的降低可以反映藥物能夠對PCPA誘導的失眠小鼠起到改善作用，所以該結果表明酸棗仁-茯苓-黨參水提物能夠降低失眠小鼠興奮性，對失眠小鼠起到一定的鎮(zhèn)靜作用。

圖1 酸棗仁-茯苓-黨參水提物對失眠小鼠自主活動的影響（n=10）Fig.1 Effects of Ziziphi Spinosae Semen, Poria Cocos and Codonopsis Radix on the autonomic activity in insomnia mice (n=10)

2.2 酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠腦組織的影響

2.2.1 對小鼠腦組織5-HT與TPH含量的影響

2.2.1.1 5-HT與TPH標準曲線建立 將濃度分別為0、15、30、60、120、240 ng/mL的小鼠5-HT標準品按照試劑盒操作步驟，將標準品的濃度設為橫坐標，OD值為縱坐標，繪得標準曲線的直線方程式：y=141.62x?11.623（R2=0.9968）；將濃度分別為0、30、60、120、240、480 pg/mL的小鼠TPH標準品按照試劑盒操作步驟，將標準品的濃度設為橫坐標，OD值為縱坐標，繪得標準曲線的直線回歸方程式：y=272.23x?13.945（R2=0.9913）。將樣本OD值帶分別入以上標準直線方程式，計算樣品濃度。

2.2.1.2 對小鼠下丘腦5-HT與TPH含量的影響現(xiàn)代研究已證實，改善睡眠的機制主要與腦內血清素（5-HT）系統(tǒng)有關[34?37]。5-HT又名血清素，作為腦內主要的單胺類神經遞質，5-HT及其代謝產物含量的高低、其相關受體的活性與引起失眠病理機制密不可分[38?39]。早在1968年，Jouvet等[40]研究發(fā)現(xiàn)藥物拮抗或手術切除5-羥色胺能細胞會導致失眠的發(fā)生，并簡單得出5-羥色胺可促進睡眠的結論。通過近年來得不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)5-羥色胺在調節(jié)睡眠-覺醒周期中起到關鍵作用[41]。而今采用腹腔注射PCPA作用于動物建立的睡眠剝奪模型，其原理就是通過抑制TPH活性，阻礙5-HT合成，降低體內5-HT的含量從而達到睡眠剝奪的目的[42]。

色氨酸羥化酶（TPH）作為5-HT生物合成中的起始酶和限速酶，被認為對調節(jié)5-HT濃度有關鍵作用[43]。酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠下丘腦5-HT與TPH含量的影響見表3。結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠下丘腦中5-HT與TPH含量均顯著降低（P<0.05,P<0.01）；與模型組比較，酸棗仁-茯苓-黨參高劑量組5-HT與TPH含量均顯著升高（P<0.01,P<0.05）。表明PCPA誘導的失眠小鼠，其下丘腦血清素系統(tǒng)合成5-HT的能力降低，而56 g/kg酸棗仁-茯苓-黨參水提物能夠提高5-HT合成限速酶TPH的活性使下丘腦內5-HT的含量恢復正常水平，從而對失眠小鼠產生一定的改善作用[44]。

表3 酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠下丘腦中血清素系統(tǒng)的影響（n=10）Table 3 Effects of Ziziphi Spinosae Semen, Poria Cocos and Codonopsis Radix on the serum serotonin system in mouse hypothalamus (n=10)

2.2.1.3 對小鼠皮層5-HT與TPH含量的影響 5-HT也廣泛分布于大腦皮層中，并且近年來有研究將皮層作為參與睡眠調節(jié)的重要腦組織[45?46]。同“2.2.1.2”，本研究對小鼠皮層中5-HT與TPH含量進行檢測。酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠皮層5-HT與TPH含量的影響見表4。

結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠皮層中5-HT與TPH含量均顯著降低（P<0.05,P<0.01），表明皮層中5-HT水平的下降也能夠導致睡眠障礙；與模型組比較，酸棗仁-茯苓-黨參組5-HT與TPH含量均升高，但無顯著差異。表明雖然酸棗仁-茯苓-黨參水提物對皮層中5-HT及其合成限速酶TPH有一定的調節(jié)作用，但對其恢復正常水平無顯著影響。

表4 酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠皮層中血清素系統(tǒng)的影響（n=10）Table 4 Effects of Ziziphi Spinosae Semen, Poria Cocos and Codonopsis Radixon the serum serotonin system in mouse cortex (n=10)

2.2.2 對小鼠腦組織Glu與GABA含量的影響

2.2.2.1 Glu與GABA標準曲線建立 將濃度分別為0、3、6、12、24、48 mg/L的小鼠Glu標準品按照試劑盒操作步驟，將標準品的濃度設為橫坐標，OD值為縱坐標，繪得標準曲線的直線方程式：y=26.403x?1.4524（R2=0.9901）；將濃度分別為0、0.5、1、2、4、8 μmol/L的小鼠GABA標準品按照試劑盒操作步驟，將標準品的濃度設為橫坐標，OD值為縱坐標，繪得標準曲線的直線回歸方程式：y=4.3578x?0.1458（R2=0.9938）。將樣本OD值帶分別入以上標準直線方程式，計算樣品濃度。

2.2.2.2 對小鼠海馬Glu與GABA含量及比值的影響 神經生理學研究表明，興奮-抑制功能的失衡也能夠導致睡眠障礙[47?48]。氨基酸類神經遞質GABA是中樞神經系統(tǒng)的主要抑制性神經遞質，在睡眠調節(jié)中起著重要的作用[49]。Glu作為興奮性氨基酸類神經遞質，能夠在谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）的作用下轉化為GABA。因此，認為GABA與Glu作為腦內主要的抑制性與興奮性神經遞質，維持它們之間的穩(wěn)態(tài)平衡對改善失眠也是至關重要的[50?52]。酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠海馬中Glu與GABA含量的影響見表5。

表5 酸棗仁-茯苓-黨參水提物對失眠小鼠海馬Glu與GABA含量的影響（n=10）Table 5 Effects of Ziziphi Spinosae Semen, Poria Cocos and Codonopsis Radix on Glu and GABA in mouse hippocampus (n=10)

結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠海馬中Glu與GABA含量均顯著降低（P<0.05,P<0.01）；與模型組比較，酸棗仁-茯苓-黨參組Glu與GABA含量均無顯著差異。表明酸棗仁-茯苓-黨參水提物對PCPA誘導的失眠小鼠海馬中Glu與GABA含量無顯著影響。酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠海馬中Glu與GABA比值的影響見圖2。結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠海馬中Glu/GABA含量顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，酸棗仁-茯苓-黨參高劑量組Glu/GABA顯著降低（P<0.05），與Li等[50]的結論相一致，表明酸棗仁-茯苓-黨參水提物能夠降低因Glu占比過高或GABA占比過低引起的興奮，使其恢復平衡狀態(tài)，再次證明了Glu/GABA比值在改善睡眠中的重要性。

圖2 酸棗仁-茯苓-黨參水提物對失眠小鼠海馬Glu與GABA比值的影響（n=10）Fig.2 Effects of Ziziphi Spinosae Semen, Poria Cocos and Codonopsis Radix on the ratio of Glu to GABA in mouse hippocampus (n=10)

2.2.2.3 對小鼠皮層Glu與GABA含量及比值的影響 同“2.2.2.2”，本研究對小鼠皮層中Glu與GABA含量及比值進行分析。酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠皮層中Glu與GABA含量的影響見表6。

表6 酸棗仁-茯苓-黨參水提物對失眠小鼠皮層Glu與GABA含量的影響（n=10）Table 6 Effects of Ziziphi Spinosae Semen, Poria Cocos and Codonopsis Radix on Glu and GABA in mouse cortex (n=10)

結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠皮層中Glu與GABA含量均極顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，56 g/kg酸棗仁-茯苓-黨參組Glu與GABA含量均極顯著增加（P<0.01）。該結果通過與“2.2.2.2”海馬中Glu與GABA含量結果比較，發(fā)現(xiàn)酸棗仁-茯苓-黨參水提物均能夠使海馬與皮層中Glu和GABA含量恢復正常水平，不過在皮層中的升高作用表現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01）。酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠皮層中Glu與GABA比值的影響見圖3。結果顯示，各組小鼠皮層中Glu/GABA均無顯著差異。結果表明，雖然PCPA能夠使小鼠皮層中Glu、GABA的含量發(fā)生變化，但并不破壞二者間平衡狀態(tài)，對Glu/GABA比值無顯著影響。

圖3 酸棗仁-茯苓-黨參水提物對失眠小鼠皮層Glu與GABA比值的影響（n=10）Fig.3 Effects of Ziziphi Spinosae Semen, Poria Cocos and Codonopsis Radix on the ratio of Glu to GABA in mouse cortex (n=10)

3 結論與討論

根據(jù)國內外研究，改善失眠藥物的評價以戊巴比妥鈉誘導的睡眠模型和PCPA誘導的失眠模型為主要方法[29?30,32]。一般而言[30]，睡眠實驗包含延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗和睡眠潛伏期實驗，本研究通過分析小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間，簡單評價酸棗仁-茯苓-黨參水提物的促進睡眠及延長睡眠時間的作用，發(fā)現(xiàn)28、56 g/kg劑量可顯著降低小鼠睡眠潛伏期、延長睡眠時間，表明酸棗仁-茯苓-黨參水提物能夠與戊巴比妥鈉產生協(xié)同效應，具有良好的改善睡眠作用[34]。研究認為[28]，連續(xù)2 d腹腔注射PCPA可建立失眠模型，本實驗于第27、28 d建立失眠模型，觀察小鼠體重、毛發(fā)、攻擊性判斷模型建立成功。此外，通過曠場實驗分析小鼠自主活動能力，失眠模型小鼠水平得分與活動距離均顯著高于正常小鼠；酸棗仁-茯苓-黨參水提物顯著降低失眠小鼠水平得分與活動距離，與文獻[25,27]有相似結果，說明其能夠對PCPA誘導的興奮起到一定的鎮(zhèn)靜作用。此外，酸棗仁-茯苓-黨參水提物對正常小鼠也能夠起到相同的鎮(zhèn)靜作用。

與以往機制研究不同[44,47,49]，因中藥多成分、多途徑的特點，本實驗將下丘腦、皮層、海馬三種與睡眠緊密相關的腦組織中5-HT和GABA作為檢測對象[53]，發(fā)現(xiàn)酸棗仁-茯苓-黨參水提物（56 g/kg）能夠調節(jié)下丘腦5-HT系統(tǒng)，增強5-HT合成關鍵酶TPH的活性，從而提高5-HT含量；還能夠調節(jié)的海馬Glu與GABA含量，維持Glu/GABA平衡。雖然酸棗仁-茯苓-黨參水提物對小鼠皮層中5-HT以及Glu/GABA平衡沒有顯著作用，但研究結果顯示，低、中、高劑量水提物對皮層中5-HT及TPH的水平存在量效關系，所以今后可加大用藥劑量對其在皮層中的作用進行研究。

綜上所述，酸棗仁-茯苓-黨參水提物在催眠實驗或睡眠剝奪實驗中均表現(xiàn)出顯著效果，以56 g/kg劑量最佳，其作用途徑主要是通過調節(jié)下丘腦組織中血清素系統(tǒng)，提高5-HT含量；以及調節(jié)海馬組織中Glu與GABA含量，維持興奮性神經遞質與抑制性神經遞質之間的穩(wěn)態(tài)平衡，從而發(fā)揮改善失眠的作用，這為研究參苓棗復方口服液提供了實驗基礎，并為本課題組深入探討酸棗仁-茯苓-黨參水提物對失眠的作用信號通路提供參考。