劉 曉，朱成龍，龐月紅，馮永巍，史學(xué)麗，張 毅,

（1.江南大學(xué), 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品學(xué)院，分析食品安全學(xué)研究所，江蘇無錫 214122；2.無錫市食品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇無錫 214122；3.石家莊市婦幼保健院，河北石家莊 050051）

環(huán)境雌激素（Environmental estrogens，EEs）是一種具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的類固醇類物質(zhì)，主要包括內(nèi)源性雌激素（如雌二醇、雌三醇、雌酮、孕酮等）、外源性雌激素（如雙酚A、己烯雌酚等）以及其它具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的化合物（如滴滴涕、多氯聯(lián)苯等）[1?2]。其中，17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）具有較強(qiáng)的雌激素效應(yīng)[3]，過量攝入會(huì)干擾機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，引發(fā)生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)異常，甚至導(dǎo)致生殖器官癌變[4?5]。由于E2對(duì)動(dòng)物體的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用而被應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)[6]，并隨動(dòng)物排泄物進(jìn)入土壤、水源中，導(dǎo)致肉類、乳類、蛋類以及環(huán)境中雌激素殘留問題日益嚴(yán)重。因此，監(jiān)測(cè)食品中的E2對(duì)保障食品安全具有重要意義。

常用的E2檢測(cè)方法主要為色譜法[7?9]、免疫學(xué)方法[10]和適配體傳感法[11?12]。其中，適配體傳感器簡便、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高。適配體是通過體外指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選得到的一段能夠與靶標(biāo)特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA[13]。與抗體相比，適配體具有易于合成和修飾、穩(wěn)定性高、適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[14?16]。

目前，熒光適配體傳感器已被應(yīng)用于多種食品中污染物的檢測(cè)[12,17?19]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）原理是熒光傳感中常用的檢測(cè)原理，其實(shí)現(xiàn)條件有二，一是熒光供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜存在重疊，二是供體和受體之間的距離小于一定程度（10 nm），當(dāng)兩個(gè)條件都滿足時(shí)，供體-受體二者之間可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從而利用供-受體距離變化導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度變化反映分析物的含量[20]。常見的FRET供體有小分子熒光染料、量子點(diǎn)和上轉(zhuǎn)換納米材料等；受體有金納米粒子、氧化石墨烯和二硫化鉬納米片等[11,18，21?24]。

黑磷納米片（Black phosphorus nanosheets，BPNs）是從黑磷晶體中剝離出來的片層狀二維納米材料。它與石墨烯、石墨相氮化碳和二硫化鉬等其它二維材料有許多相似的屬性，如在紫外可見近紅外區(qū)都有較強(qiáng)的吸收、比表面積大等；同時(shí)還具有一些獨(dú)特的性能，如具有高載流子遷移率、高傳輸各向異性、層數(shù)依賴的帶隙和良好的生物相容性與生物安全性。在分析化學(xué)領(lǐng)域，BPNs最初被用在氣體和蒸汽傳感器，后來又被應(yīng)用于檢測(cè)過氧化氫[25]、無機(jī)離子[26]、疾病標(biāo)志物[27]和單鏈核酸[28]。與黑磷的另一種存在形態(tài)——黑磷量子點(diǎn)常作為FRET熒光供體的應(yīng)用方式不同，BPNs自身并不發(fā)光但卻具有廣泛的吸收光譜，因此BPNs可以作為FRET熒光受體實(shí)現(xiàn)FRET過程[5,28]。與金納米粒子需通過巰基末端共價(jià)結(jié)合核酸的修飾方式不同，BPNs中的P原子可以通過范德華力將單鏈核酸吸附在其表面進(jìn)而使標(biāo)記在單鏈核酸上的熒光團(tuán)淬滅，但它對(duì)雙鏈核酸和與靶標(biāo)結(jié)合的適配體卻沒有吸附，故而無需修飾即可用于構(gòu)建FRET體系。

因此，本文通過超聲輔助液相剝離法制備BPNs并將其作為FRET受體，以6-羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的E2適配體（FAM-Apt）作為FRET供體，構(gòu)建熒光適配體傳感器，應(yīng)用于E2的定量分析，并對(duì)其檢測(cè)性能和實(shí)際應(yīng)用性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

17β-雌二醇適配體（5’-FAM-GCC-GTT-TGGGCC-CAA-GTT-CGG-C-3’） 生工生物工程（上海）股份有限公司；黑磷晶體 南京先豐納米材料科技有限公司；17β-雌二醇（E2）、雌三醇（E3）、雙酚A（BPA）、己烯雌酚（DS）、孕酮（P4） 上海阿拉丁生物技術(shù)有限公司；三羥基氨基甲烷（Tris）、氯化鈉（NaCl）、氯化鎂（MgCl2）、氯化鉀（KCl）、鹽酸（HCl）、乙醇（C2H5OH）、冰醋酸 分析純，北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；自來水 本實(shí)驗(yàn)室；牛奶 本地超市。

Synergy H1多功能微孔板檢測(cè)儀 美國伯騰儀器有限公司；F-7000熒光分光光度計(jì)、JEM-2100型透射電鏡 日本日立公司；UV-3600PLUS紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；ZEN3700型納米粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；3K30高速離心機(jī)

美國熱電公司；Scientz-IID型超聲波細(xì)胞破碎儀

寧波新芝生物科技股份有限公司；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；冷凍干燥機(jī) 北京博勱行儀器有限公司；BSA124S型電子天平 北京賽多利斯公司；渦旋振蕩器 德國艾卡公司；ST3100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 奧豪斯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑磷納米片的制備與表征 采用超聲輔助液相剝離法制備黑磷納米片（BPNs）。稱取25 mg黑磷晶體（BP）于研缽中，加入少量水濕磨，然后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中加水約25 mL制成懸濁液，懸濁液經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎儀冰浴超聲10 h（超聲功率300 W，工作4 s停4 s）后，4000 r/min離心15 min，棄去未剝離的黑磷沉淀，上清液經(jīng)真空冷凍干燥后得到尺寸較小的BPNs，將得到的BPNs配制成1 mg/mL的分散液備用。

所制備的BPNs使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值（掃描范圍400～900 nm，采樣間隔0.5 nm，玻璃比色皿狹縫寬度2 mm，光程10 mm，規(guī)格0.7 mL）；取少量溶液稀釋超聲，吸取10 μL滴加至覆有碳膜的銅網(wǎng)上，干燥后采用JEM2110透射電鏡（工作電壓200 kV）進(jìn)行表征；采用布魯克Dimension原子力顯微鏡（探針型號(hào)SCANASYST-AIR，掃描速率1.0 Hz，掃描像素256×256）進(jìn)行片層厚度表征；采用納米粒度儀（以超純水作為溶劑，平衡時(shí)間120 s）測(cè)定水合粒徑[29]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 使用乙醇溶液（分析純）分別配制1 mg/mL的17β-雌二醇、雌三醇、雙酚A、己烯雌酚、孕酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液由1 mg/mL的儲(chǔ)備液稀釋得到，溶劑為Tris-HCl緩沖溶 液（100 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、25 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2，pH7.54）。6-羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的適配體4000 r/min離心1 min后，用超純水溶解至100 μmol/L備用。所有溶液置于?4 ℃保存。

1.2.3 檢測(cè)方法及條件優(yōu)化

1.2.3.1 檢測(cè)原理 檢測(cè)原理如圖1所示，將FAMApt與BPNs混合后，F(xiàn)AM-Apt吸附在BPNs表面，二者發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)AM的熒光被淬滅；當(dāng)體系中存在E2時(shí)，E2與適配體特異性結(jié)合引起適配體構(gòu)象改變，使FAM-Apt從BPNs表面脫離，F(xiàn)AM的熒光恢復(fù)，其恢復(fù)程度與目標(biāo)物的濃度呈線性關(guān)系，據(jù)此可以實(shí)現(xiàn)對(duì)E2的定量分析。

1.2.3.2 檢測(cè)方法 取96孔黑色酶標(biāo)板，分別加入50 μL FAM-Apt和50 μL BPNs，混合均勻后立即加入150 μL E2標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液，混勻后室溫避光孵育一定時(shí)間，然后用多功能微孔板檢測(cè)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度（Ex=490 nm，Em=520 nm），平行測(cè)定三次。以F0表示空白組（E2濃度為0 ng/mL）的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)表示樣品溶液的熒光強(qiáng)度，傳感器的傳感信號(hào)用相對(duì)熒光強(qiáng)度（F/F0）表示。

1.2.3.3 條件優(yōu)化 對(duì)BPNs濃度、FAM-Apt濃度和孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)FAM-Apt濃度為2.5 nmol/L時(shí)，考察不同BPNs濃度（5、10、15、20、40 μg/mL）反應(yīng)20 min后傳感器對(duì)E2的響應(yīng)。然后在不同F(xiàn)AM-Apt濃度（1.25、2.5、5、7.5、10 nmol/L）的反應(yīng)體系中等比例加入對(duì)應(yīng)濃度的BPNs（5、10、20、30、40 μg/mL），孵育20 min后測(cè)定熒光強(qiáng)度。在BPNs和FAM-Apt濃度分別為30 μg/mL和7.5 nmol/L的條件下，考察不同孵育時(shí)間（10、20、30、35、40、50、60 min）下傳感器對(duì)E2的響應(yīng)。

1.2.4 特異性研究 96孔黑色酶標(biāo)板中加入50 μL 37.5 nmol/L FAM-Apt，50 μL 50 μg/mL BPNs，再分別加入150 μL空白對(duì)照溶液，100 ng/mL E2標(biāo)準(zhǔn)溶液和E2結(jié)構(gòu)類似物（雌三醇、雙酚A、己烯雌酚、孕酮）標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫下避光孵育30 min后測(cè)定熒光強(qiáng)度，平行測(cè)定三次。

1.2.5 實(shí)際樣品分析 為驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性和對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)能力，測(cè)定了自來水和市售牛奶樣品并進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。首先稱取2 g牛奶樣品，加入乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.6以沉淀蛋白質(zhì)，10 °C 7000 r/min離心10 min，取上清液備用。處理后的牛奶樣品和自來水分別按照1:20的體積比用緩沖溶液稀釋，然后加入不同濃度的E2標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、4.5、30、60 ng/mL），按照1.2.3.2所述方法測(cè)定熒光強(qiáng)度，平行測(cè)定三次，外標(biāo)法定量并計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2018對(duì)得到的吸光度值、熒光強(qiáng)度值、水合粒徑分布進(jìn)行處理，并繪制紫外可見吸收光譜、熒光光譜和水合粒徑分布圖。使用NanoScope Analysis導(dǎo)入AFM圖，選取對(duì)應(yīng)位置分析高度，并使用Origin 2018繪制對(duì)應(yīng)位置高度圖。使用SPSS進(jìn)行單因素顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑磷納米片的表征

超聲輔助液相剝離方法可以打破黑磷層間范德華力，將黑磷晶體剝離成少層甚至單層的黑磷納米（BPNs）。對(duì)所制備的BPNs進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示。透射電鏡（TEM）顯示該BPNs具有獨(dú)立的片層結(jié)構(gòu)，大部分納米片都小于200 nm；由粒度儀獲得水合粒徑圖可以看出該BPNs尺寸分布較為均勻，水合粒徑平均值為310.3 nm；使用原子力顯微鏡（AFM）分析材料的厚度，結(jié)果表明該BPNs片層厚度約為4 nm，對(duì)應(yīng)大約2～4層[29]；與黑磷晶體相比，BPNs在400～600 nm范圍內(nèi)吸收明顯增強(qiáng)。以上表征結(jié)果共同證明由BP晶體成功剝離得到尺寸較小、層數(shù)較少的BPNs。

圖1 基于FRET原理測(cè)定17β-雌二醇（E2）的熒光適配體傳感示意圖Fig.1 Schematic illustration of fluorescence aptasensor for detection of 17β-estradiol (E2) based on FRET

圖2 BPNs的TEM圖（a），水合粒徑（b）以及BP和BPNs的吸收光譜（c）； BPNs的AFM圖（d）和圖（d）中對(duì)應(yīng)位置的高度分析（e）Fig.2 The TEM image (a), hydrodynamic diameter distribution (b) of BPNs; the absorption spectrum of BP and BPNs (c);AFM image of BPNs (d) and corresponding height analysis of BPNs in figure (e)

2.2 E2檢測(cè)

2.2.1 可行性檢測(cè) 圖3（a）為BPNs的吸收光譜與FAM-Apt和E2的熒光發(fā)射光譜圖。BPNs的吸收范圍與FAM-Apt的發(fā)射范圍存在重疊；在FAMApt的熒光測(cè)試條件下，E2不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)干擾。因此，該體系滿足了FRET的第一個(gè)條件，即熒光供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜存在重疊。以60 ng/mL E2進(jìn)行熒光淬滅和恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3（b）所示。與FAM-Apt相比，加入BPNs后FAM的熒光被顯著淬滅，E2的加入使被淬滅的熒光有所恢復(fù)，證明FRET體系的可行性。

2.2.2 條件優(yōu)化 BPNs濃度影響FAM的淬滅程度，進(jìn)而影響檢測(cè)方法的靈敏度，因此BPNs的濃度對(duì)傳感器的構(gòu)建有重要影響。如圖4（A）所示，隨著BPNs濃度增加，F(xiàn)AM-Apt的熒光強(qiáng)度逐漸降低。但當(dāng)體系中BPNs的濃度過高時(shí)，與E2競(jìng)爭結(jié)合適配體的程度大大增加，導(dǎo)致FAM-Apt與E2的結(jié)合不穩(wěn)定，加入目標(biāo)物后熒光恢復(fù)不明顯。以F/F0為縱坐標(biāo)作圖可得，BPNs的濃度為10 μg/mL時(shí)熒光強(qiáng)度恢復(fù)最明顯。

適配體作為傳感器的識(shí)別元件對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度具有重要影響，因此對(duì)FAM-Apt的濃度進(jìn)行考察。由圖4（B）可以看出，隨著FAM-Apt度增加，響應(yīng)信號(hào)逐漸增大，F(xiàn)AM-Apt濃度為7.5 nmol/L時(shí)熒光恢復(fù)強(qiáng)度最大，繼續(xù)增大FAM-Apt濃度后響應(yīng)信號(hào)降低，可能是因?yàn)檫^高的FAM-Apt濃度導(dǎo)致傳感器對(duì)低濃度目標(biāo)物響應(yīng)不靈敏。因此，選擇7.5 nmol/L作為FAM-Apt的最終濃度。

圖3 不同條件下FAM-Apt熒光強(qiáng)度變化Fig.3 Fluorescence intensity of FAM-Apt under different conditions

圖4 BPNs濃度（A）、FAM-Apt濃度（B）和反應(yīng)時(shí)間（C）對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of BPNs concentration (A), E2 aptamer concentration (B) and incubation time (C)on the relative fluorescence intensity

BPNs淬滅FAM需要一定的時(shí)間，適配體與目標(biāo)物也需要一段時(shí)間才能完成結(jié)合過程，因此對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果如圖4（C）所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，體系的熒光恢復(fù)強(qiáng)度逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)相對(duì)熒光強(qiáng)度最大，此后稍有降低。因此，最終的反應(yīng)時(shí)間確定為30 min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在確定的最優(yōu)條件下，將不同濃度（0～300 ng/mL）的E2標(biāo)準(zhǔn)溶液加入反應(yīng)體系中，測(cè)定體系熒光恢復(fù)強(qiáng)度，以驗(yàn)證本方法的靈敏度，確定線性范圍和檢測(cè)限。由圖5（a）可得，隨著E2濃度增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)體系中E2濃度達(dá)到300 ng/mL時(shí)，熒光強(qiáng)度與E2濃度的關(guān)系偏離線性。以520 nm處的相對(duì)熒光強(qiáng)度（F/F0）對(duì)E2濃度作圖，結(jié)果如圖5（b）所示。從圖中可以看出，E2濃度在1.5～60 ng/mL的范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.00987x+1.1458（R2=0.9845）。以3N/S（N指空白樣品信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差，S指標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率）計(jì)算檢測(cè)限為1.0 ng/mL。以上結(jié)果表明，該方法具有良好的準(zhǔn)確性和靈敏度。

圖5 不同濃度E2對(duì)傳感器的熒光響應(yīng)Fig.5 Fluorescence intensity against different concentrations of E2

表1列舉了本方法與之前報(bào)道的其它E2檢測(cè)方法的比較結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)所述方法具有與納米金比色法相當(dāng)?shù)木€性范圍和靈敏度，在滿足食品樣品檢測(cè)要求的前提下能夠在一定程度上避免納米金比色法和電化學(xué)方法抗干擾能力差的缺點(diǎn)。

2.4 特異性研究

為了驗(yàn)證本方法對(duì)E2的選擇性，選擇E2的結(jié)構(gòu)類似物雌三醇、雙酚A、己烯雌酚、孕酮進(jìn)行特異性研究，E2和四種結(jié)構(gòu)類似物的濃度均為60 ng/mL，測(cè)定結(jié)果如圖6所示。由于E2與適配體特異性結(jié)合，導(dǎo)致FAM-Apt從BPNs表面脫離，F(xiàn)AM-Apt熒光恢復(fù)；而結(jié)構(gòu)類似物與適配體結(jié)合的親和力較低，加入反應(yīng)體系后不能引起FAM-Apt從BPNs表面脫離，因此熒光恢復(fù)不明顯。以上結(jié)果表明，構(gòu)建的基于適配體的熒光傳感器對(duì)E2具有良好的選擇性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的特異性檢測(cè)。

2.5 實(shí)際樣品分析

為了驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性和在實(shí)際樣品中的應(yīng)用能力，對(duì)自來水和牛奶樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。樣品中分別加入不同濃度(0、4.5、30、60 ng/mL)的E2，按本方法測(cè)定E2含量，回收率結(jié)果如表2所示。自來水和牛奶樣品的回收率分別為91.2%～104.8%和87.5%～104.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為4.99%～10.53%和4.48%～11.24%。以上結(jié)果表明，本方法可以應(yīng)用于自來水和牛奶樣品中E2的檢測(cè)。

表1 不同17β-雌二醇檢測(cè)方法的比較Table 1 Comparison of different detection methods of 17β-estradiol

圖6 熒光適配體傳感器的選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Specificity results of fluorescence aptasensor

表2 實(shí)際樣品中雌二醇加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery results of 17β-estradiol in real samples (n=3)

3 結(jié)論

利用FAM標(biāo)記的E2適配體作為熒光供體，BPNs作為熒光受體，基于FRET原理構(gòu)建了熒光適配體傳感器用于E2的檢測(cè)。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，本方法在1.5～60 ng/mL的范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為1.0 ng/mL，且檢測(cè)特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好，本方法可以實(shí)現(xiàn)雌二醇的快速靈敏檢測(cè)。自來水和牛奶樣品中加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果理想，表明該方法具有實(shí)際樣品檢測(cè)能力。與傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法相比，本方法操作簡單，成本低，30 min即可完成檢測(cè)，在E2檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。