穆談航，葉 嘉，楊明建，苗俊玲，王新建，周小桐，張文文

（1.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北邯鄲 056005；2.河北省高校冀南太行山區(qū)野生資源植物應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北邯鄲 056005）

石榴富含維生素、有機酸、糖類、蛋白質(zhì)、脂肪，鈣、磷、鉀等礦物質(zhì)[1]，以及豐富的多酚類物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗癌[2]和保護心腦血管[3]及止血[4]的藥用價值。

目前，對于多酚的提取方法主要有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法和超臨界流體萃取法，而相比較來說超聲波輔助提取法能有效提高總多酚的提取速率，具有時間短、提取量高的優(yōu)點。但是，不同的超聲波工藝在實際應(yīng)用方面效果存在一定差異。因此，需要進一步探究石榴多酚的最佳提取工藝。本研究首先進行了多酚最佳提取工藝的確定，為后續(xù)研究多酚儲藏穩(wěn)定性打下了基礎(chǔ)。目前，針對多酚的研究主要集中在抑菌和抗氧化的功能上，對其儲藏穩(wěn)定性的研究卻比較少見，而乳化劑可以提高食品品質(zhì)[5]。及保存性質(zhì)[6]。

本研究將石榴多酚與乳化劑復(fù)配后，來研究乳化劑對多酚儲藏穩(wěn)定性的影響，旨在解決多酚儲藏時不穩(wěn)定、暴露在空氣中易被氧化的問題，以期為多酚類天然活性物質(zhì)的儲藏穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。首先，以80%甲醇作為提取劑，利用超聲波輔助法[7]，通過單因素和正交試驗確定本探究中多酚的最佳提取工藝；由于乳化劑具有良好的保鮮及抗氧化[8]特性，利用這一特性將多酚與單硬脂酸甘油酯[9]和蔗糖脂肪酸酯兩種乳化劑制成不同的乳化體系，加入到石榴多酚提取液中，通過實驗確定石榴多酚的最佳保存方法，研究不同乳化體系對多酚提取液儲藏穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴 突尼斯軟籽石榴；甲醇（色譜純） 天津賽孚瑞科技有限公司、沒食子酸（99%） 安徽酷爾生物工程有限公司、福林-酚試劑Ⅱ（1mol/L H+） 天津市光復(fù)精細化工研究所；無水碳酸鈉（分析純） 天津奧普升化工有限公司；單硬脂酸甘油酯（食品級）河南千志商貿(mào)有限公司；SE-11蔗糖脂肪酸酯（食品級） 柳州愛格富食品科技股份有限公司。

KS-100B旋鈕超聲波清洗器 昆山潔力美超聲儀器有限公司；ThermoHeraeus Multifuge X1R臺式離心機 美國Thermo公司；PA3201B電子天平上海天美天平儀器有限公司；HH2恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SK-1快速混勻器金壇市科析儀器有限公司；TGL-18B臺式高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠

1.2 實驗方法

1.2.1 石榴多酚提取工藝 采用齊迪[10]的提取方法并略有改動，取1 g新鮮石榴皮放入研缽研碎。加入80%的甲醇作為浸提劑，多次沖洗研缽將研碎的石榴皮轉(zhuǎn)移到小燒杯中。然后放入超聲波清洗器中，在不同條件下提取多酚，比較多酚含量，得出最優(yōu)提取工藝。超聲結(jié)束后將固體和液體轉(zhuǎn)移到離心管中進行離心，離心條件為5 ℃、轉(zhuǎn)速為10000 r/min，15 min。上清即為石榴皮多酚的提取液[11]。

1.2.2 石榴多酚提取單因素實驗 設(shè)置超聲波功率固定為160 W，80%的甲醇[12]作為浸提液，在條件相同下，以多酚含量為指標(biāo)，分別考察成熟程度（幼期7～8月、成熟前期8～9月、成熟期9～10月、成熟后期10～11月）、料液比[13]（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25）、提取時間[14]（10、20、30、40、50 min）、提取溫度[15]（10、20、30、40、50 ℃）、避光反應(yīng)時間（10、20、30、40、50 min）5個因素影響。

1.2.3 多酚測定方法 樣品測定：采用齊迪[10]的測定方法，并略有改動。將一定量的多酚粗提液稀釋至100倍，取1 mL稀釋液于試管中并分別加入福林-酚試劑Ⅱ 0.2 mL，水6 mL，10%碳酸鈉1 mL。在室溫下避光反應(yīng)30 min，在A=765 nm下測定吸光值。用水做空白對照，每組三個平行。

以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中溶質(zhì)溶度（mg/mL）為X軸，吸光度A為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=12.149x+0.0093，R2=0.9991。

式中，c：沒食子酸濃度，mg/mL；m：石榴皮質(zhì)量，g；v：稀釋液體積，mL。

1.2.4 正交實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，考察因素為成熟程度、料液比、提取溫度、提取時間，以多酚含量為考察指標(biāo)，對超聲波輔助法提取石榴皮多酚的提取工藝進行研究。正交試驗因素水平表如表1[16]所示。

表1 正交實驗因素表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.5 不同乳化劑對多酚儲藏穩(wěn)定性的影響 本實驗分別探究質(zhì)量分數(shù)（乳化劑與粗提液質(zhì)量比）為0.6%、0.8%、1%的蔗糖脂肪酸酯[17]和單硬脂酸甘油酯[17]溶解于食用油和水中對石榴皮多酚粗提液儲藏穩(wěn)定性的影響。共形成12種不同的乳化體系（蔗糖酯可做抗老化劑[18]，探究儲藏效果），設(shè)置不同的時間梯度，在765 nm下測定吸光值，以吸光值的變化率為儲藏率指標(biāo)。

制備方法：分別稱取質(zhì)量分數(shù)0.6%、0.8%、1%的兩種乳化劑與2 mL的調(diào)和油和水分別混合，放入水浴鍋中5 min（70 ℃左右），用快速混勻器輔助使其充分混合形成乳化體系，用石榴皮多酚的粗提液定容到10 mL（1:5）。再次放入水浴鍋中3 min（70 ℃左右），使其與多酚粗提液充分混合，取部分液體于離心管中，10000 r/min離心3 min，取上清測定其吸光值。其余液體放入5 ℃左右的冰箱中儲藏。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗平行測定3次，單因素實驗、儲藏穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)處理及正交試驗表格用Excel作圖，用SPSS 20.0軟件進行正交分析、方差分析，以P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 成熟程度對石榴多酚提取的影響 由圖1可知，石榴的不同成熟程度對石榴皮多酚的提取存在較大的影響，石榴在生長7～8個月的幼期時，石榴皮多酚含量達到5.55 mg/g，石榴在生長10～11個月的成熟后期多酚含量最低，降至3.62 mg/g。在石榴整個生長過程中，石榴皮多酚含量變化率在53.3%左右，隨著石榴的不斷成熟，石榴皮多酚的含量逐漸下降，不同的時期石榴皮多酚含量存在明顯差異，因此在石榴皮多酚提取的優(yōu)化中，不同的成熟程度為重要單因素之一。原因可能是，隨著石榴的生長，其石榴表皮細胞經(jīng)歷成熟、老化的生理過程，在這個過程中細胞內(nèi)部生理代謝旺盛，需要消耗大量的有機物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)，且產(chǎn)生一些氧化物質(zhì)，從而消耗部分多酚類物質(zhì)參與細胞內(nèi)的氧化過程，隨著細胞的逐漸衰老，次級代謝產(chǎn)物的消耗大于積累，造成多酚含量逐漸降低。因此石榴皮多酚提取的最佳時期在幼期。

圖1 成熟程度對多酚提取的影響Fig.1 Effects of maturity on polyphenols extraction

2.1.2 料液比對石榴多酚提取的影響 由圖2可知，從料液比在1:5～1:10之間，多酚含量隨之上升，當(dāng)料液比為1:10時，多酚含量達到最大值7.3 mg/g，此時提取率達17.31%；當(dāng)料液比大于1:10時，多酚含量逐漸降低。這是因為當(dāng)料液比增大時，多酚等物質(zhì)向細胞外擴散的濃度梯度逐漸增大，擴散速率加快，使得多酚能夠更多地進入到溶液中，多酚含量逐漸升高[19]。但料液比達到一定程度以后，該擴散速率達到最大值，多酚得率不再升高，繼續(xù)增加溶劑反而會稀釋多酚提取液溶度[20]。因此，適宜的料液比為1:10。

圖2 料液比對多酚提取的影響Fig.2 Effect of material liquid ratio on polyphenols extraction

2.1.3 提取時間對石榴多酚提取的影響 由圖3可知，提取時間由10～40 min之間多酚含量呈上升趨勢，提取時間為40 min時，多酚含量達最大值為6.6 mg/g，提取率達33.79%，此后多酚含量出現(xiàn)下降趨勢。如果多酚提取時間太短，胞內(nèi)物質(zhì)不易溶出，10 min時多酚含量僅為4.37 mg/g，提取率比較低；如果提取時間過長，多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)容易遭到破壞，從而影響石榴皮多酚提取效果[21]。因此，適宜的提取時間為40 min。

圖3 提取時間對多酚提取的影響Fig.3 Effect of extraction time on polyphenol extraction

2.1.4 提取溫度對石榴多酚提取的影響 由圖4可知，在20 ℃時多酚含量達最大值為7.16 mg/g，在此之前，很可能是由于溫度過低，導(dǎo)致多酚溶出速度過慢，效率比較低[22]。在20 ℃時達到最大值之后，隨著溫度的逐漸升高，多酚的提取量隨之下降，是因為多酚類物質(zhì)受熱穩(wěn)定性較差，過高的溫度使得多酚結(jié)構(gòu)容易被破壞，對多酚本身結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響，從而導(dǎo)致多酚含量降低[23]。因此，適宜的提取溫度為20 ℃左右。

圖4 提取溫度對多酚提取的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on polyphenol extraction

2.1.5 避光反應(yīng)時間對石榴多酚提取的影響 由圖5可知，避光反應(yīng)時間在30～50 min之間時多酚含量趨于平穩(wěn)，10、20 min時多酚含量明顯低于30 min時的多酚含量，20 min時多酚含量為4.90 mg/g，與最高值相差42.04%，因此避光反應(yīng)時間對多酚含量測定存在較大影響。原因可能是在30 min之前，該體系反應(yīng)不完全，導(dǎo)致吸光值低。因此，適宜的反應(yīng)時間為40 min。

圖5 避光反應(yīng)時間對多酚提取的影響Fig.5 Effect of dark reaction time on polyphenol extraction

因為避光反應(yīng)時間在30～50 min范圍內(nèi)變化趨勢不明顯，因此不選做正交試驗考察因素。綜上，選取成熟度、料液比、提取時間、提取溫度四個因素進行正交試驗。

2.2 正交試驗

為了進一步探究各因素對石榴皮多酚超聲提取的影響，對表2中的數(shù)據(jù)進行方差分析，由于D因素的R值最小，將其作為空白列進行分析，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，對石榴皮多酚超聲波輔助法提取工藝優(yōu)化試驗中，所考察的四個因素對石榴皮多酚的提取均無顯著性影響。由表2可知，表中最佳的為4組合A2B1C1D1，總多酚的含量為10.74 mg/g，由k值得到的最佳組合為A1B1C2D3。為驗證結(jié)果，分別用A1B1C2D3和A2B1C1D1兩種提取方法提取多酚，石榴皮多酚的含量分別為11.47 mg/g和10.11 mg/g。結(jié)果表明，石榴皮多酚提取的最佳工藝條件是：A1B1C2D3，即：成熟程度為幼期，料液比為1:5，提取溫度為20 ℃，提取時間為50 min。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis results of variance

2.3 不同乳化體系對多酚提取液儲藏穩(wěn)定性的影響

2.3.1 蔗糖脂肪酸酯對多酚粗提液穩(wěn)定性影響 通過研究蔗糖酯分別以水和食用油為連續(xù)相形成的6種不同的乳化體系發(fā)現(xiàn)（圖6），以食用油為連續(xù)相的實驗組，沒有以水為連續(xù)相時的留存率高。儲藏15 d后，以食用油為連續(xù)相的實驗組中，質(zhì)量分數(shù)為1.0%的乳化體系多酚留存率最高，達98.58%，對照組僅為63.34%；以水為連續(xù)相的實驗組中，質(zhì)量分數(shù)為1.0%的乳化體系多酚留存率最高，達104.24%，對照組僅為71.62%，以水為連續(xù)相儲藏效果優(yōu)于以食用油為連續(xù)相。這是由于蔗糖酯是水溶性表面活性劑，在水相中具有更好的分散和穩(wěn)定性[24]。但是，不管在油相還是水相中，隨著蔗糖酯質(zhì)量分數(shù)的增加，多酚留存率均呈上升趨勢，說明蔗糖酯形成的乳化體系對多酚的儲藏有積極作用，且在一定范圍內(nèi)與其質(zhì)量分數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。

圖6 蔗糖酯對多酚穩(wěn)定性影響Fig.6 Effect of sucrose fatty acid ester on the stability of polyphenols

2.3.2 單硬脂酸甘油酯對多酚粗提液穩(wěn)定性影響 由圖7可知，以食用油為連續(xù)相的實驗組，比以水為連續(xù)相時留存率高。儲藏15 d后，以食用油為連續(xù)相的實驗組中，質(zhì)量分數(shù)為1.0%的乳化體系多酚留存率最高，達85.42%，對照組僅為69.24%；以水為連續(xù)相的實驗組中，質(zhì)量分數(shù)為0.6%的乳化體系多酚留存率最高，達85.14%，對照組僅為73.45%，說明單甘脂在以食用油為連續(xù)相時儲藏效果優(yōu)于以水為連續(xù)相。這是由于單甘脂為脂溶性表面活性劑，在油相中具有更好的分散和穩(wěn)定性。但是，與蔗糖酯相比，單甘脂的保存效果仍然偏低，故對于石榴多酚儲藏穩(wěn)定性來說，質(zhì)量分數(shù)為1.0%的蔗糖酯與水形成的乳化體系保存效果最佳。

圖7 單甘酯對多酚穩(wěn)定性影響Fig.7 Effect of monostearate on stability of polyphenols

3 結(jié)論

首先采用單因素和正交試驗的方法，得到了各因素對石榴皮多酚粗提液的影響大?。毫弦罕?成熟程度>提取溫度>提取時間。優(yōu)化的石榴皮多酚超聲輔助法提取工藝為：成熟程度為幼期，料液比為1:5，提取溫度為20 ℃，提取時間為50 min，此時多酚最佳含量為11.47 mg/g。

在儲藏穩(wěn)定性實驗中，蔗糖酯以水為連續(xù)相形成的乳化體系對石榴多酚儲藏效果優(yōu)于以食用油為連續(xù)相，而單甘酯則與之相反。這與兩種表面活性劑的HLB值有關(guān)，親水親油性決定了它們形成復(fù)合體系的分散和穩(wěn)定性，也決定了它們對多酚的保護作用。這兩種不同的乳化劑相比，蔗糖酯對多酚儲藏穩(wěn)定性的作用效果優(yōu)于單甘酯，且效果在一定范圍內(nèi)與蔗糖酯的添加量呈正相關(guān)關(guān)系。