姜 甜，陸文偉,2，崔樹茂，張 灝,2,3，趙建新,2,

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122；2.江南大學(xué)（揚(yáng)州）食品生物技術(shù)研究所，江蘇揚(yáng)州 225004；3.江南大學(xué)國家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇無錫 214122）

雙歧桿菌是一種存在于宿主腸道內(nèi)具有益生功能的微生物，它具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，抵抗病原微生物及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等功能[1?2]?；罹鷶?shù)是評價益生菌功能的重要指標(biāo)，一般認(rèn)為益生菌的數(shù)量應(yīng)高于106～107CFU/g時，益生益才能在宿主腸道中定殖并發(fā)揮益生功能[3]。提高益生菌進(jìn)入腸道的存活率可保障足夠的活菌數(shù)量，所以必須要提供有效的物理屏障以抵御宿主體內(nèi)高胃酸和膽鹽等不利環(huán)境[4]。在眾多方法中，用微膠囊包埋雙歧桿菌是最有效、最有前景的一種方法[5]，良好的微膠囊雙歧桿菌可安全通過外界環(huán)境和胃液等到達(dá)腸道，從而增加腸道中活性雙歧桿菌的數(shù)量[6?7]，同時可實現(xiàn)其在腸道中的精準(zhǔn)緩釋[8]。ERATTE D等[9]研究證實，微囊化技術(shù)可顯著提高干酪乳桿菌黏附在腸壁絨毛上的存活能力，因此可作為不影響其功能特性的腸道黏膜微粒遞送系統(tǒng)。

雙歧桿菌能否對機(jī)體產(chǎn)生功能與其能否在消化道內(nèi)粘附和定植有關(guān)，其中粘附是其發(fā)揮功能的先決條件[10?11]。在人體腸道內(nèi)，粘附是益生菌定植于腸上皮細(xì)胞的前提，是細(xì)菌與宿主細(xì)胞相互作用的第一步，對維持腸道菌群的結(jié)構(gòu)及功能起主導(dǎo)作用。在體內(nèi)比較難以研究益生菌對人腸道上皮細(xì)胞的黏附性，常在體外通過人結(jié)腸癌細(xì)胞系的Caco-2 細(xì)胞株模型研究益生菌黏附能力，Caco-2 細(xì)胞株在體外培養(yǎng)后能較好地模擬人體腸上皮細(xì)胞的成熟形態(tài)[12]。同時研究表明[13?14]，菌體表面疏水性、自聚集能力與細(xì)菌粘附性存在一定的相關(guān)性，菌體黏附能力與其表面性質(zhì)有直接關(guān)系。微生物的粘附作用分為兩步：第一步是非特異性粘附，第二步是菌體的特殊配體進(jìn)一步與宿主細(xì)胞相應(yīng)的受體進(jìn)行特異性結(jié)合，即粘附素-受體學(xué)說。CAMP等[15]研究指出雙歧桿菌細(xì)胞壁的脂磷壁酸（LTA）中的脂肪酸是其粘附于人腸道上皮細(xì)胞的主要介導(dǎo)物質(zhì)，其粘附能力似乎取決于細(xì)胞濃度和作用時間長短。大量無菌老鼠實驗揭示了胃腸道菌群定植不足與腸道運(yùn)動障礙有緊密的聯(lián)系[16?18]，因此有足夠數(shù)量的菌群粘附并定植于腸道能促進(jìn)腸道蠕動。

本文首次用靜電噴霧微囊化技術(shù)包埋益生菌，即在較低溫度（室溫～90 ℃）的惰性環(huán)境中（氧氣體積含量<5%）產(chǎn)生靜電霧化，使益生菌進(jìn)行微囊化和干燥。從通過體外模擬消化道仿生系統(tǒng)后的存活率、疏水性、自沉淀性能、粘附性能和脂磷壁酸中的脂肪酸含量等方面比較不同微囊化方法的乳雙歧桿菌BL03，乳雙歧桿菌BAL005、兩歧雙歧桿菌BB30、長雙歧桿菌BLL2、嬰兒雙歧桿菌BI20的差異，初步討論不同微囊化雙歧桿菌菌粉特性，通過不同微囊化方法來分析影響腸道蠕動和腸道菌群的因素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳雙歧桿菌BL03、乳雙歧桿菌BAL005、兩歧雙歧桿菌BB30、長雙歧桿菌BLL2、嬰兒雙歧桿菌BI20 江南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；MEM培養(yǎng)液（含20%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%雙抗、1%谷氨酞胺） 美國Gibco公司；TritonX -ll4（IXll4） 美國Sigma公司；DEAE-Sephace CL-6B Solarbio；乙酰氯甲醇，甲苯，十六烷，醋酸銨，磷酸氫鈣 中國醫(yī)藥集團(tuán)；海藻糖 Amresco公司；麥芽糊精 羅蓋特；亞麻酸陜西晨明生物；阿拉伯膠 安徽宏通生物；脫脂乳粉 新西蘭恒天然；海藻酸鈉 河南優(yōu)元；β-環(huán)糊精 興生物；脂肪酸甘油三酯，純度≥99% Sigma公司；MRS培養(yǎng)基 青島海博；解囊液Na2HPO4·12H2O溶液35.8 g/L，檸檬酸溶液10.5 g/L，pH7.4，滅菌備用；消化液 0.25%胰蛋白酶，0.03%EDTA，pH7.6～8.0；PBS緩沖液：NaCl 8 g，KCI 0.2 g，Na2HPO47H2O1.14 g，加水定容至1000 mL，pH7.4；口腔唾液 準(zhǔn)確稱取6.2 g NaCl，2.2 g KCl，1.2 g NaHCO3，溶于800 mL水中，室溫攪拌，待充分溶解后，稱取0.22 g CaCl2溶于溶液中，用蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)pH至6.9，121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后，加入3 gα-amylase，0.22 μm過濾除菌；食管到胃連續(xù)過程的模擬液 MRS肉湯培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%胃蛋白酶，分別調(diào)pH至5.5、4.6、3.8、2.8、2.0，用0.22 μm的微孔濾膜過濾備用；十二指腸模擬液：MRS肉湯培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%胰蛋白酶和0.3%膽鹽，調(diào)節(jié)pH至5.5，用 0.22 μm的微孔濾膜過濾備用?；啬c模擬液：0.1 mol/L NaHCO3溶液將十二指腸模擬液調(diào)至pH6.8，0.22 μm的微孔濾膜過濾備用。

PolarDry Model 050 Electrostatic Spray Dryer靜電噴霧干燥儀 Fluid Air；Smart Coater DII-29030SCTR勻膠機(jī)、SEM JCM-7000臺式掃描電子顯微鏡

日本JEOL；FA1004分析天平 上海天平儀器廠；SPX-160B-W恒溫水浴鍋，YXT-LS壓力蒸汽滅菌鍋

上海博訊；TGL-30M臺式高速離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表；SCL-1500超凈工作臺 北京賽伯樂儀器；S20C型pH計 上海雷磁儀器廠；移液器ThermoFisher；DNP-L10恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備；LGJ-20真空冷凍干燥機(jī) 北京松源科技；24孔板 Costa公司；7890A氣相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[19]，將Caco-2細(xì)胞凍存管置于37 ℃水浴鍋中復(fù)蘇，5000 r/min離心5 min，在離心所得菌體中加入4 mL MEM培養(yǎng)液，置于5%CO2?95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%時，消化傳代，通常是1～2 d更換培養(yǎng)液，4 d傳代1次。

1.2.2 微囊化方法

1.2.2.1 靜電噴霧干燥雙歧桿菌 在液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，溫度（37±1） ℃，離心（8000 r/min，4 ℃，10 min）收集菌體，用生理鹽水洗滌，將細(xì)胞懸液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%海藻糖，10%亞麻酸，6%磷酸氫鈣，11%β-環(huán)糊精的保護(hù)劑混合均勻。靜電噴霧干燥設(shè)備進(jìn)風(fēng)溫度80 ℃，出風(fēng)溫度40 ℃，氣體流速25 N3/h，進(jìn)液泵速30 r/min，靜電壓力25 kV，霧化壓力230 kPa。

1.2.2.2 常規(guī)噴霧干燥雙歧桿菌 在液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，溫度（37±1） ℃，離心（8000 r/min，4 ℃，10 min）收集菌體，生理鹽水洗滌，以脫脂乳粉、麥芽糊精、阿拉伯膠作為保護(hù)劑，菌體與保護(hù)劑以1:2重量比例進(jìn)行乳化保護(hù)，噴霧干燥條件：進(jìn)風(fēng)溫度130 ℃，出風(fēng)溫度80 ℃，物料泵流量45 r/min。

1.2.2.3 乳化冷凍干燥雙歧桿菌 在液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，溫度（37±1） ℃，離心（8000 r/min，4 ℃，10 min）收集菌體，生理鹽水洗滌，以脫脂乳粉、海藻糖、海藻酸鈉作為保護(hù)劑，菌體與保護(hù)劑以1:2重量比例進(jìn)行乳化保護(hù)，1000 r/min乳化10 min，真空冷凍干燥機(jī)中干燥，凍干條件：–50 ℃預(yù)冷凍2 h，逐步升溫至?18 ℃干燥24 h，再升溫至28 ℃干燥4 h，周期48 h。

1.2.3 微膠囊包埋率的測定 分別取1 g雙歧桿菌靜電噴霧干燥菌粉、常規(guī)噴霧干燥菌粉和乳化冷凍干燥菌粉，加入9 mL pH 7.4的解囊液中，37 ℃振蕩完全崩解后，用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，測定活菌數(shù)。

分別取1 g雙歧桿菌靜電噴霧干燥菌粉、常規(guī)噴霧干燥菌粉和乳化冷凍干燥菌粉，加入9 mL稀釋液中，37 ℃振蕩完全稀釋后，用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋并測定活菌數(shù)。按公式（1）計算菌株包埋率：

式中：C1，稀釋液中的活菌數(shù)，CFU/g；C0，解囊液中的活菌數(shù)，CFU/g，進(jìn)行3次平行實驗。

1.2.4 模擬體外消化道過程 將不同方法微囊化的雙歧桿菌菌粉按最終體系菌體濃度為1010CFU/mL的量接入口腔唾液中，作用5 min，離心收集菌體，接入食管到胃連續(xù)過程的模擬液中，pH 5.5模擬液中作用10 min后離心收集菌體，再接入pH 4.6模擬液中，20 min后收集菌體，再接入pH3.8模擬液中，20 min后收集菌體，再接入pH 2.8模擬液中，處理30 min后收集菌體，再接入pH 2.0模擬液中，處理30 min后收集菌體，并測定活菌數(shù)，計算存活率。再將在pH 2.0模擬胃液后收集的菌體接入十二指腸模擬液，作用2.0 h后收集菌體，測定活菌數(shù)，計算存活率。將十二指腸模擬液作用后所收集的菌體接入回腸模擬液，作用3 h后收集菌體，取樣測定活菌數(shù)，計算存活率。

1.2.5 活菌數(shù)測定 以無菌吸管吸取樣品25 mL放入裝有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。用微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL，注于裝有9 mL生理鹽水的無菌試管中，振搖試管使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。另取1 mL微量移液器吸頭, 按上述操作順序。選擇2～3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿，將冷卻至46 °C的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿，轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。（36±1） °C厭氧培養(yǎng)（72±2） h，培養(yǎng)后計數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。選取菌落數(shù)在30～300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)，每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。

1.2.6 雙歧桿菌疏水性、自沉淀性能測定 雙歧桿菌疏水性[20]：將模擬體外消化道過程處理后的菌體重懸于PBS緩沖液中，在600 nm處調(diào)節(jié)吸光值為0.7～0.8（記作A0）。取3 mL該菌液，加0.6 mL十六烷，渦旋徹底混合3 min，37 ℃靜止30 min后去除十六烷相，測定600 nm下的水相吸光值（記作A），按式（2）計算試驗菌株疏水性：

式中：A0：菌體懸液的吸光值，A：水相的吸光值，進(jìn)行3次平行實驗。

雙歧桿菌自沉淀性能[21]：將模擬體外消化道過程處理后的菌體重懸于PBS緩沖液中，調(diào)節(jié)600 nm下的吸光值在0.7～0.8之間（記作A0）。將細(xì)胞懸液振蕩30 s，37 ℃靜置120 min，吸取1 mL靜置后的上清液，在600 nm處測定吸光值（記作A）。按公式（3）計算菌株自沉淀性：

式中：A0：菌體懸液的吸光值，A：靜置后吸光值，進(jìn)行3次平行實驗。

1.2.7 雙歧桿菌粘附性能測定 參考文獻(xiàn)[22]，將已培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞株制成懸液（105個/mL），接種細(xì)胞培養(yǎng)液，置于24孔板中，每孔內(nèi)加入1 mL細(xì)胞懸液，于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)至單細(xì)胞貼壁。以無菌PBS液洗滌3次，每孔加入1 mL菌液（模擬體外消化過程不同微囊化菌體，菌量106CFU/mL）與1 mL MEM細(xì)胞培養(yǎng)液的混合液，37 ℃，5%CO2?95%空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。用無菌PBS洗滌細(xì)胞除去未結(jié)合的細(xì)菌，火焰固定，革蘭氏染色，顯微鏡下隨機(jī)挑選20個視野，計數(shù)100個細(xì)胞上粘附的細(xì)菌數(shù)，做3個平行，再計算平均每個細(xì)胞所粘附的細(xì)菌數(shù)。

1.2.8 雙歧桿菌細(xì)胞壁脂磷壁酸的提取及其脂肪酸的測定 脂磷壁酸的提?。簩⒛M消化道環(huán)境處理后的菌體l g混懸于10 mL2%曲拉通TX114溶液中，低速攪拌過夜，溫度4 ℃，5000 r/min離心30 min，去除離心底部細(xì)菌碎片，收集上層提取物。提取物50 ℃水浴30 min，提取物分兩層，收集上層水相。DEAE-Sephace CL-6B凝膠液灌注入層柱內(nèi)，當(dāng)凝膠高度距離柱頂3～5 cm時，關(guān)閉出口液，將pH4.70，0.1 mol/L醋酸銨緩沖液平衡柱子過夜。設(shè)置上樣及洗脫程序，當(dāng)275 nm處吸收值小于0.01時，再用pH4.70，1 mol/L醋酸銨緩沖液洗脫，洗脫速度0.5 mL/min，每隔8 min收集一管，使脂磷壁酸從凝膠中洗脫完全。

脂肪酸的測定：稱取脂磷壁酸試樣0.5 g（精確到0.1 mg）至15 mL干燥玻璃管中，加入5.0 mL甲苯和6.0 mL 10%乙酰氯甲醇溶液，充氮?dú)?，旋緊螺旋蓋，振蕩混勻，于（80±1）℃水浴中放置2 h，每隔20 min振搖一次，水浴后冷卻至室溫。分別用3.0 mL碳酸鈉溶液清洗三次，收集于50 mL離心管中，5000 r/min離心5 min，上清液為試液，用色譜儀測定。準(zhǔn)確吸取脂肪酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL至15 mL螺口玻璃管中，加入4.5 mL甲苯，其他操作同上，平行測定兩次。色譜柱：固定液100%二氰丙基聚硅氧烷，100 m×0.25 mm，0.20 μm；載氣：氮?dú)?；載氣流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；分流比：30:1；檢測器溫度：280 ℃；柱溫：初始溫度140 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升溫至240 ℃，保持15 min，進(jìn)樣量：1.0 μL。

試樣中各脂肪酸含量的計算公式如式（4）：

式中：X1—試樣中各脂肪酸的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；

Asi—試樣測定液中各脂肪酸的峰面積；

mstdi—在標(biāo)準(zhǔn)測定液的制備中吸取的脂肪酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)工作液中含有的標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；

Fj—各脂肪酸甘油三酯轉(zhuǎn)化為脂肪酸的換算系數(shù)

AStdi—標(biāo)準(zhǔn)測定液中各脂肪酸的峰面積；

m—試樣的稱樣質(zhì)量，單位為克（g）。

以兩次獨(dú)立測量結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均為3組重復(fù)，結(jié)果以x±s表示，采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微囊化雙歧桿菌包埋率測定

分別將不同雙歧桿菌在靜電噴霧干燥、常規(guī)噴霧干燥和乳化干燥下進(jìn)行微囊化處理，微囊化包埋率如圖1所示。由圖1可知，不同雙歧桿菌靜電噴霧微囊化包埋率均明顯高于乳化冷凍和常規(guī)噴霧微囊化包埋率，靜電噴霧微囊化乳雙歧桿菌BL03的包埋率高達(dá)93.31%±3.16%，與實驗中乳化冷凍干燥比較，各菌株有極顯著性差異（P<0.01）。推測與不同微囊化方法包埋菌體所形成的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)，說明靜電噴霧微囊化是包埋雙歧桿菌比較好的方法。

圖1 不同微囊化雙歧桿菌的包埋率Fig.1 Embedding rates of different microencapsulated Bifidobacterium

2.2 模擬消化系統(tǒng)后的存活率分析

圖2 不同微囊化方法雙歧桿菌通過模擬胃液存活率Fig.2 Survival rates of different microencapsulated Bifidobacterium in simulated gastric fluid

圖3 不同微囊化方法雙歧桿菌通過模擬十二指腸存活率Fig.3 Survival rates of different microencapsulated Bifidobacterium in simulated duodenum fluid

圖2是不同微囊化方法包埋雙歧桿菌通過模擬胃液后活菌數(shù)變化情況，由圖2可知，靜電噴霧微囊化雙歧桿菌通過模擬胃液后存活率高于常規(guī)噴霧和乳化冷凍干燥雙歧桿菌，靜電噴霧干燥乳雙歧桿菌BL03存活率達(dá)80.92%±4.51%，與實驗中乳化冷凍干燥比較，各菌株有極顯著性差異（P<0.01）。圖3是不同微囊化方法包埋雙歧桿菌繼續(xù)通過模擬十二指腸后的活菌數(shù)變化情況，靜電噴霧微囊化雙歧桿菌通過模擬十二指腸后存活率高于乳化冷凍干燥雙歧桿菌，各菌株有極顯著性差異（P<0.01）。圖4是不同微囊化方法包埋雙歧桿菌繼續(xù)通過模擬回腸后的活菌數(shù)變化情況，靜電噴霧微囊化雙歧桿菌通過模擬回腸后存活率高于常規(guī)噴霧微囊化和乳化冷凍干燥雙歧桿菌，與實驗中乳化冷凍干燥比較，各菌株有極顯著性差異（P<0.01）。靜電噴霧干燥乳雙歧桿菌BL03通過模擬胃液、十二指腸和回腸等消化道后存活率高達(dá)55.01%±4.12%，乳雙歧桿菌BAL005和嬰兒雙歧桿菌BI20的存活率高達(dá)50.16%±3.52%。綜合可知，靜電噴霧微囊化雙歧桿菌在模擬消化系統(tǒng)中的存活率優(yōu)于常規(guī)噴霧干燥和乳化冷凍干燥。

2.3 模擬消化系統(tǒng)后的疏水性能

由圖5可知，經(jīng)過模擬胃液、十二指腸和回腸等消化道作用后，不同雙歧桿菌的疏水性差異較大，除長雙歧桿菌BLL2外，靜電噴霧微囊化雙歧桿菌疏水性效果優(yōu)于常規(guī)噴霧和乳化冷凍微囊化，與試驗中乳化冷凍微囊化比較，各菌株均有極顯著性差異（P<0.01），且乳雙歧桿菌組疏水性差異更大，靜電噴霧微囊化雙歧桿菌疏水性比乳化冷凍微囊化雙歧桿菌提高125.14%～368.75%。DEL等[23]研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌表面疏水性與其宿主腸上皮細(xì)胞黏附能力呈正相關(guān)。推測靜電噴霧干燥雙歧桿菌黏附能力優(yōu)于常規(guī)噴霧干燥和乳化冷凍干燥，其更易黏附并定植于機(jī)體消化道內(nèi)壁。

圖4 不同微囊化方法雙歧桿菌通過模擬回腸存活率Fig.4 Survival rates of different microencapsulated Bifidobacteriumin simulated ileum fluid

圖5 不同微囊化方法雙歧桿菌疏水率Fig.5 Hydrophobic property of different microencapsulated Bifidobacterium

2.4 模擬消化系統(tǒng)后的自沉淀性能

由圖6可知，經(jīng)模擬胃液、十二指腸和回腸等消化道仿生系統(tǒng)作用后，不同雙歧桿菌的自沉淀性能差異較大，靜電噴霧微囊化和常規(guī)噴霧微囊化雙歧桿菌自沉淀率均優(yōu)于乳化凍干微囊化，靜電噴霧微囊化雙歧桿菌自沉淀率比乳化冷凍微囊化雙歧桿菌提高112.50%～372.72%。研究表面，菌體的自沉淀性能有助于形成生物膜，從而能夠在腸道內(nèi)占位，并抑制致病菌對人體腸道的侵襲[24]。

2.5 模擬消化系統(tǒng)后的粘附性能

圖6 不同微囊化方法雙歧桿菌自沉淀率Fig.6 Deposition rate of different microencapsulated Bifidobacterium

由圖7可知，經(jīng)模擬胃液、十二指腸和回腸等消化道后，不同雙歧桿菌粘附性能差異較大，但靜電噴霧和常規(guī)噴霧微囊化雙歧桿菌對Caco-2細(xì)胞的粘附性均明顯高于乳化冷凍微囊化，與實驗中乳化冷凍微囊化比較，各菌株有極顯著性差異（P<0.01），除長雙歧桿菌BLL2外，靜電噴霧微囊化雙歧桿菌粘附性比乳化冷凍微囊化雙歧桿菌提高109.52%～411.11%。通過比較，靜電噴霧微囊化乳雙歧桿菌BL03和BAL005粘附性能均高于常規(guī)噴霧，由圖7可知，其靜電噴霧干燥乳雙歧桿菌BL03粘附數(shù)達(dá)（46.18±2.82）CFU/cell，推測可能是因為乳雙歧桿菌是動物來源雙歧桿菌。DEL等[23]研究發(fā)現(xiàn)，不同種類長雙歧桿菌間黏附能力存在差異性。推測其黏附能力的差異可能與不同微囊化保護(hù)劑成分有關(guān)，如糖類和金屬離子等，也與不同微囊化包埋效果以及對經(jīng)模擬消化道環(huán)境等條件脅迫反應(yīng)作用不同有關(guān)。

圖7 不同微囊化方法雙歧桿菌菌體粘附數(shù)Fig.7 Adhesion number of different microencapsulated Bifidobacterium

2.6 雙歧桿菌細(xì)胞壁脂磷壁酸中脂肪酸含量變化

表1是不同微囊化方法雙歧桿菌經(jīng)過胃液、十二指腸、回腸等消化道仿生系統(tǒng)后脂磷壁酸中檢出的6種脂肪酸含量情況，由表1可知，雙歧桿菌細(xì)胞壁脂磷壁酸主要以飽和脂肪酸為主，其中C12:0和C6:0含量較多，以C12:0脂肪酸含量最多；通過模擬消化道仿生系統(tǒng)后靜電噴霧和常規(guī)噴霧微囊化雙歧桿菌C12:0和C6:0脂肪酸含量高于乳化冷凍微囊化雙歧桿菌；通過模擬消化道仿生系統(tǒng)后靜電噴霧和常規(guī)噴霧微囊化雙歧桿菌C18:1n9c不飽和脂肪酸含量低于乳化冷凍微囊化雙歧桿菌。

可以推測，雙歧桿菌在模擬消化道環(huán)境下C12:0和C6:0飽和脂肪酸會轉(zhuǎn)化成C18:1n9c不飽和脂肪酸，可能是消化道環(huán)境脅迫作用的結(jié)果，細(xì)胞壁脂磷壁酸中脂肪酸組成的變化是雙歧桿菌對消化道環(huán)境脅迫產(chǎn)生的應(yīng)對策略。Wang[25]等研究發(fā)現(xiàn)，在脅迫環(huán)境下乳酸菌細(xì)胞會通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸組成來進(jìn)行自我保護(hù)，與本文研究結(jié)果一致。

表1 不同微囊化雙歧桿菌細(xì)胞壁脂磷壁酸中脂肪酸含量Table 1 The fat acid content of lipoteichoic acid of different microencapsulated Bifidobacterium

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)考察靜電噴霧等不同微囊化方法包埋雙歧桿菌的特性，研究其通過模擬消化道仿生系統(tǒng)后的存活率、疏水性、自沉淀率和粘附性等。靜電噴霧微囊化乳雙歧桿菌BL03在經(jīng)過胃液、十二指腸、回腸后存活率高達(dá)55.01%±4.12%，存活率最高。不同微囊化雙歧桿菌的疏水性和自沉淀率差異明顯，靜電噴霧微囊化乳雙歧桿菌的疏水性更強(qiáng)。通過模擬消化系統(tǒng)后，不同微囊化雙歧桿菌粘附性能差異顯著，靜電和常規(guī)噴霧微囊化雙歧桿菌的粘附性能明顯優(yōu)于乳化冷凍微囊化，靜電噴霧微囊化乳雙歧桿菌BL03的粘附數(shù)高達(dá)（46.18±2.82） CFU/cell，靜電噴霧微囊化乳雙歧桿菌BL03包埋率高達(dá)93.31%±3.16%。進(jìn)一步分析不同微囊化菌株通過模擬消化道后脂磷壁酸中脂肪酸含量的差異，靜電噴霧和常規(guī)噴霧微囊化雙歧桿菌C12:0與C6:0脂肪酸含量高于乳化冷凍微囊化，但其C18:1n9c不飽和脂肪酸含量低于乳化冷凍微囊化雙歧桿菌。推測C12:0、C6:0飽和脂肪酸含量和C18:1n9c不飽和脂肪酸含量在一定程度上可反映雙歧桿菌粘附性能差異。

大量研究已證明疏水性、自沉淀率與粘附性之間的相關(guān)性，同時，也有研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌細(xì)胞壁的脂磷壁酸中脂肪酸是其粘附腸上皮細(xì)胞的主要介導(dǎo)物質(zhì)。粘附性是益生菌發(fā)揮功效作用的先決條件，與腸道蠕動能力和腸道菌群有密切關(guān)系，在模擬消化道仿生系統(tǒng)環(huán)境脅迫下，靜電噴霧干燥是雙歧桿菌比較良好的微囊化方法，對開發(fā)和研究具有緩解便秘等性能的雙歧桿菌有一定意義。