楊 爽 ，肖 瑜

（1.吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院分子營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130052；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118）

玉米是我國第三大糧食作物，也是我國重要的農(nóng)產(chǎn)品，2019年我國玉米總產(chǎn)量已達(dá)2.608億噸[1]。相關(guān)統(tǒng)計(jì)表明，全球1/3人口以玉米為主食[2]。而我國玉米的消費(fèi)形式，大部分以飼料用糧和工業(yè)原料為主。玉米主食的加工也仍然停留在粗淺階段，大部分傳統(tǒng)的玉米主食產(chǎn)品無法滿足人們對(duì)營養(yǎng)、衛(wèi)生和安全的需要，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益水平偏低[3]。玉米風(fēng)味獨(dú)特，但食用品質(zhì)差，具有加工性能低的缺點(diǎn)，如玉米主食產(chǎn)品普遍存在產(chǎn)品硬度大、易老化、口感粗糙[4]等問題。玉米主食產(chǎn)品中的原料玉米粉淀粉含量約70%，淀粉的消化性與人體的許多疾病密切相關(guān)。淀粉的消化性受多種因素影響，包括淀粉的來源、直鏈/支鏈淀粉比例、支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)等，而玉米淀粉大部分是由支鏈淀粉組成，易被人體消化吸收[5]。這些都在一定程度上制約了玉米主食工業(yè)化的發(fā)展。

近年來，關(guān)于谷物性質(zhì)改良研究越來越多[6?7]，微生物發(fā)酵技術(shù)是其中的一種安全性和適用性較好的改良技術(shù)。蛹蟲草（Cordyceps militaris（L） Link），又名為北蟲草、北冬蟲夏草，是食品研究中被廣泛應(yīng)用的食藥用真菌，人們?cè)诠δ芑钚猿煞种苽?、產(chǎn)品研發(fā)等方面做了大量的工作[8?9]。近幾年，越來越多研究者利用蟲草發(fā)酵改善農(nóng)產(chǎn)品功能特性與營養(yǎng)特性，包括以鷹嘴豆[10]、紅豆[11]和燕麥[12]等為底物利用蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵，提高底物活性成分含量及功能活性研究。當(dāng)前研究中，關(guān)于蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵對(duì)玉米粉加工特性和消化性的影響研究還未見報(bào)道。因此，本研究利用蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵，旨在改良玉米粉的性質(zhì)，從而為蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵技術(shù)改良谷物性質(zhì)的處理方法提供參考，同時(shí)為玉米主食制品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草菌株 由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥和玉米國家工程實(shí)驗(yàn)室提供；總淀粉試劑盒、直鏈淀粉/支鏈淀粉試劑盒K-TSTA 愛爾蘭Megazyme；D-葡萄糖檢測(cè)試劑盒K-GLUC 愛爾蘭Megazyme；豬胰α-淀粉酶（A3176） 8×USP/mg，美國Sigma-Aldrich公司；淀粉葡萄糖苷酶（A7095） 260 U/mL，美國Sigma-Aldrich公司。

全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；快速粘度測(cè)定儀 澳大利亞Perten公司；物性儀 英國Stable Micro Systems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固態(tài)發(fā)酵 參考前期實(shí)驗(yàn)室蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵玉米粉的發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，利用蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵玉米粉，具體步驟如下：將活化后的蛹蟲草斜面菌種切成1 cm×1 cm菌塊接種到液體種子培養(yǎng)基中，24 ℃，160 r/min搖床震蕩培養(yǎng)3 d，將液體種子破碎后接種到滅菌后玉米粉中，接種量為10%（干重），置于24 ℃下培養(yǎng)5 d后滅活終止反應(yīng)，在不同發(fā)酵時(shí)間取3瓶樣品，于60 ℃下烘干至恒重，滅菌后玉米粉作為對(duì)照。將烘干后的發(fā)酵產(chǎn)物過80目備用。

1.2.2 理化成分的測(cè)定

1.2.2.1 總淀粉和直鏈淀粉含量的測(cè)定 采用總淀粉試劑盒和直鏈淀粉/支鏈淀粉試劑盒測(cè)定發(fā)酵前后總淀粉和直鏈淀粉含量。

1.2.2.2 粗脂肪含量的測(cè)定 參考GB/T 5009.6-2003食品中脂肪的測(cè)定[13]。

1.2.2.3 可溶性蛋白含量的測(cè)定 采用福林-酚方法[14]。稱取1.5 g樣品加入6 mL水，45 ℃提取2 h，超聲30 min，4000×g 離心10 min，取上清13000×g離心10 min，取上清過0.22 μm濾膜，取0.2 mL濾液加定容至1 mL，空白1 mL水，500 nm酶標(biāo)儀OD值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用牛血清蛋白稀釋液，根據(jù)牛血清蛋白稀釋液濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y=0.47945x+0.00177，R2=0.9951。

1.2.2.4 氨基酸的測(cè)定 Li等[15]方法。準(zhǔn)確稱取發(fā)酵過程中粉末0.1 g，加10 mL 6 mol/L的HCl，再加100 μL的β-巰基乙醇，置于液氮中冷凍，冷凍后利用氮?dú)膺M(jìn)行封管約80 S以上，再將水解管放在110 ℃烘箱中水解22 h。水解結(jié)束后取3 mL樣品進(jìn)行濃縮，取2 mL pH 2.2的三氯乙酸加入濃縮后樣品中，在4 ℃條件下保持2 h，過0.22 nm有機(jī)膜，利用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定17種常見氨基酸含量，氨基酸含量為g/100 g。

1.2.3 水溶指數(shù)（water-solubility index, WSI）和吸水指數(shù)（water-absorption index, WAI）測(cè)定 參考Siroha等[16]的方法，取發(fā)酵前后的樣品，粉碎過80目篩，2.5 g，置于已知重量離心管中，加入30 mL蒸餾水，攪拌30 min，4000×g 離心10 min，將上清液倒入鋁盒，烘干至恒重稱重，同時(shí)稱量離心沉淀的重量。WSI和WAI計(jì)算如下：

1.2.4 糊化特性的測(cè)定 利用快速粘度測(cè)定儀（Rapid Visio Analyser, RVA）進(jìn)行測(cè)定：稱4.0 g 樣品置于盛有25 mL蒸餾水的鋁盒中，裝入RVA上，按下塔帽進(jìn)行測(cè)試。在160 r/min下攪拌混合，樣品在50 ℃下保持l min；然后再以12 ℃/min的速度升溫至 95 ℃；保持95 ℃條件下2.5 min，以12 ℃/min的速度降至50 ℃；在50 ℃保持1.4 min，得到樣品的糊化曲線。記錄樣品的峰值粘度、谷值粘度、衰減值、回生值、峰值時(shí)間。

1.2.5 質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定 參考于長籌[17]的方法。將糊化后的樣品，4 ℃下貯藏24 h制備凝膠，取樣利用物性儀測(cè)定凝膠的質(zhì)構(gòu)特性。具體參數(shù)為：測(cè)試前速度：2.00 mm/s；測(cè)試中速度：2.00 mm/s；測(cè)試后速度：1.00 mm/s；形變量：20%；兩次下壓間隔時(shí)間：5 s；負(fù)載力：5 g。探頭類型：P2.5。

1.2.6 體外消化性的測(cè)定 淀粉體外消化率參考Englyst等[18]方法測(cè)定：800 mg樣品置于15 mL乙酸鈉緩沖溶液（0.1 mol/L，pH 5.2）。37 ℃下平衡10 min，加5 mL混合酶溶液（淀粉酶和淀粉葡糖苷酶），于37 ℃恒溫水浴搖床酶解。在20、120 min分別取出0.5 mL，并與4 mL無水乙醇混合滅酶，4500×g離心10 min。使用K-GLUC試劑盒測(cè)上清中葡萄糖含量?？煜矸郏≧DS），慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）的含量根據(jù)以下公式計(jì)算：

式中，G0：上清液中樣品的游離葡萄糖含量，G20：20 min時(shí)釋放的葡萄糖含量，G120：120 min時(shí)釋放的葡萄糖含量，W是樣品的重量，TS是總淀粉含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)試驗(yàn)至少做三次平行試驗(yàn)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析與相關(guān)性分析，用OriginPro 8.5軟件做分析圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵對(duì)玉米粉理化成分組成的影響

發(fā)酵對(duì)玉米粉理化組成的影響結(jié)果如表1所示，固態(tài)發(fā)酵對(duì)玉米粉理化成分產(chǎn)生明顯影響，其中發(fā)酵初期（0～2 d），發(fā)生略微變化，而隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，即發(fā)酵的第3 d，理化成分出現(xiàn)顯著變化（P<0.05）。其中，總淀粉含量隨發(fā)酵時(shí)間延長呈顯著下降的趨勢(shì)（P<0.05），說明蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵對(duì)玉米淀粉具有較好的水解力。到第3 d，總淀粉降低了11.7%。與此同時(shí)，直鏈淀粉含量明顯增加，到第3 d增加了29.8%。劉紅艷等[19]研究表明，食用菌在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生α-淀粉酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶，將大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)。蛹蟲草發(fā)酵過程中產(chǎn)生的α-淀粉酶水解淀粉，主要發(fā)生在支鏈淀粉的長鏈部分，使其分解為直鏈淀粉或者葡萄糖等小分子，使得支鏈淀粉含量降低，直鏈淀粉含量增加。這和猴頭菌固態(tài)發(fā)酵玉米粉結(jié)果中直鏈淀粉含量增加，支鏈淀粉含量降低結(jié)果一致[20]。玉米中的蛋白質(zhì)主要是水溶性較差的醇溶蛋白，而可溶性蛋白含量較少，不易被生物體所利用。由表1所示，發(fā)酵0～2 d，可溶性蛋白增加緩慢，3 d后可溶性蛋白含量明顯增加。雖然在發(fā)酵0～2 d，可溶性蛋白含量變化不顯著（P>0.05），但由表2可看出固態(tài)發(fā)酵顯著增加了必需氨基酸和總氨基酸含量（P<0.05），即發(fā)酵初期即可改善玉米蛋白氨基酸的組成，到發(fā)酵的第3 d，必需氨基酸和總氨基酸含量分別增加了26%和28.7%，其中蘇氨酸、纈氨酸和蛋氨酸分別增加了39.1%、42.8%和81.8%。Angulobejarano等[21]利用米曲霉固態(tài)發(fā)酵鷹嘴豆粉，對(duì)其蛋白中氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵可提高含硫氨基酸（蛋氨酸、半胱氨酸）、蘇氨酸和纈氨酸等必需氨基酸含量。根據(jù)相關(guān)報(bào)道[22]，蛹蟲草酶系發(fā)達(dá)，能夠分泌大量的淀粉酶、纖維酶、蛋白酶、肽酶等，可以將淀粉和蛋白質(zhì)水解成低聚糖、葡萄糖、多肽、肽和氨基酸等。表2結(jié)果表明玉米蛋白被分解成了氨基酸、多肽和一些有一定空間結(jié)構(gòu)但分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)，增加了蛋白質(zhì)的溶解性，使得可溶性蛋白含量增加。

表1 發(fā)酵對(duì)玉米粉理化成分組成影響Table 1 Effect of fermentation time on physicochemical composition of corn flour

2.2 發(fā)酵對(duì)玉米粉水溶指數(shù)（WSI）和吸水指數(shù)（WAI）的影響

水溶指數(shù)和吸水指數(shù)是玉米粉加工過程中重要的應(yīng)用性質(zhì)，WSI 和 WAI 分別反映了粉體的降解和糊化程度，其中 WAI 越大，產(chǎn)品會(huì)產(chǎn)生黏牙感，會(huì)對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)造成一定影響[23]，因此對(duì)發(fā)酵前后玉米粉的WSI和WAI進(jìn)行測(cè)定。如圖1所示，固態(tài)發(fā)酵顯著提高WSI（P<0.05），在發(fā)酵第5 d，WSI增加了274.4%；與此同時(shí)，WAI隨發(fā)酵時(shí)間的延長呈下降的趨勢(shì)，到第5 d，降低40.4%，這和黑曲霉固態(tài)發(fā)酵高粱粉，WAI呈增加的結(jié)果不同[24]。這可能是由于所選擇的微生物菌種不同，具有不同的生長特性和產(chǎn)生不同的發(fā)酵產(chǎn)物。雖然在固態(tài)發(fā)酵過程中，利用微生物酶解作用來改良谷物粉的品質(zhì)特性，但不同于其他微生物，蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵酶解玉米粉的同時(shí)，其產(chǎn)生的菌絲體覆蓋在了玉米粉表面，可能導(dǎo)致其不利于淀粉與水發(fā)生水合作用。此外，有研究[25]認(rèn)為在淀粉體系中，添加蔗糖等可溶性成分可與體系中自由水發(fā)生相互作用，抑制淀粉的吸水作用。蛹蟲草發(fā)酵過程中產(chǎn)生的可溶性成分，如多糖、可溶性蛋白等，與淀粉競爭吸水，不利于淀粉與水相互作用，使得WAI降低。

表2 發(fā)酵對(duì)玉米粉氨基酸組成影響Table 2 Effect of fermentation time on amino acids of corn flour

圖1 發(fā)酵對(duì)玉米粉水溶指數(shù)和吸水指數(shù)的影響Fig.1 Effect of fermentation time on WSI and WAI of corn flour

2.3 發(fā)酵對(duì)玉米粉糊化特性影響

發(fā)酵對(duì)玉米粉糊化性質(zhì)影響結(jié)果如表3所示。由表3可看出，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，淀粉被不斷水解，整體上，發(fā)酵后玉米粉糊化峰值粘度、谷值粘度、衰減值和回生值隨之降低，到發(fā)酵第3 d，其分別降低了47.3%、43.7%、85.4%和34.9%。在0～2 d，糊化黏度參數(shù)的上升，可能是由于在發(fā)酵初期雖然總淀粉含量變化不顯著（P>0.05），但微生物的酶解破壞了淀粉顆粒，有研究認(rèn)為絲狀真菌發(fā)酵可破壞淀粉顆粒表面，使其表面出現(xiàn)孔洞[26]，從而有利于糊化過程中水分的擴(kuò)散，有利于吸水膨脹，從而使黏度增加。發(fā)酵第5 d，峰值粘度和谷值粘度又出現(xiàn)上升的現(xiàn)象，但仍低于未發(fā)酵樣品。這表明固態(tài)發(fā)酵后玉米粉的糊化黏性參數(shù)，仍是主要受淀粉濃度和結(jié)構(gòu)決定的，但與此同時(shí)，微生物發(fā)酵過程中發(fā)生的一系列復(fù)雜反應(yīng)，菌絲體產(chǎn)生的多糖、可溶性蛋白等成分，也對(duì)黏度參數(shù)產(chǎn)生一定影響，使得發(fā)酵后玉米粉黏度增加。

2.4 發(fā)酵對(duì)玉米粉凝膠質(zhì)構(gòu)特性影響

由圖2中可知，在發(fā)酵的0～2 d，玉米粉凝膠的硬度、彈性、黏合度和咀嚼性略微下降；而隨著發(fā)酵時(shí)間增加，淀粉被不斷水解，玉米粉凝膠的硬度和咀嚼性顯著下降（P<0.05），到發(fā)酵的第3 d，凝膠硬度和咀嚼性分別降低了45.4%和34.8%。玉米粉主食制品在貯藏過程中，常存在老化、咀嚼性差等問題，這也是限值玉米主食制品發(fā)展的主要原因之一，由圖2的結(jié)果可看出，發(fā)酵降低凝膠的硬度和咀嚼性，表明發(fā)酵可抑制玉米淀粉老化，提高產(chǎn)品適口性。玉米粉凝膠硬度的降低可能與總淀粉含量下降（表1）有關(guān)，固態(tài)發(fā)酵玉米粉中淀粉水解是凝膠硬度降低的主要原因。發(fā)酵到第5 d時(shí)，淀粉進(jìn)一步被降解，凝膠硬度下降過多，凝膠呈軟塌狀態(tài)，失去玉米粉凝膠結(jié)構(gòu)，不利于凝膠制品結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。以上結(jié)果表明，利用蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵對(duì)玉米粉淀粉進(jìn)行適度的水解，可降低凝膠硬度，抑制玉米制品的老化，但過度水解淀粉，會(huì)喪失玉米淀粉的凝膠結(jié)構(gòu)，有不利的影響。

表3 發(fā)酵對(duì)玉米粉糊化特性影響Table 3 Effect of fermentation time on pasting properties of corn flour

2.5 發(fā)酵對(duì)淀粉消化性影響

淀粉消化性是影響淀粉類食品營養(yǎng)功能發(fā)揮的重要因素，因此對(duì)發(fā)酵前后淀粉消化性進(jìn)行測(cè)定。從圖3可以看出，固態(tài)發(fā)酵可以改變玉米淀粉中RDS、SDS和RS的含量，顯著影響其消化特性。在發(fā)酵0～2 d，固態(tài)發(fā)酵可使玉米淀粉中RDS含量下降，而SDS含量增加；在發(fā)酵的3～5 d，固態(tài)發(fā)酵使SDS和RS均顯著增加（P<0.05），在發(fā)酵的第3 d，SDS和RS分別提高至原來的1.83和1.41倍。有研究認(rèn)為[27]，淀粉的消化性與淀粉顆粒大小、直鏈淀粉含量以及支鏈淀粉分支結(jié)構(gòu)等有關(guān)。圖3結(jié)果表明，SDS和RS隨直鏈淀粉含量的增加而增加。Miao等[28]分析認(rèn)為α-淀粉酶水解玉米淀粉后，可生成具有分支結(jié)構(gòu)的低聚糖，這些低聚物不易被人體消化，使得RS增加。這與本研究結(jié)果中RS含量增加相似。RS不能被消化，有利于腸道健康。這表明利用蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵玉米粉，可提高SDS和RS含量。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，淀粉繼續(xù)被水解，在發(fā)酵4～5 d，隨著可溶性蛋白、SDS和RS含量進(jìn)一步增加，可進(jìn)一步改善玉米粉營養(yǎng)性質(zhì)。但當(dāng)發(fā)酵至第5 d時(shí)，總淀粉含量降低程度較大，使得凝膠硬度下降過多，凝膠呈軟塌狀態(tài)，不利于玉米主食制品結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此，需要控制微生物對(duì)淀粉的水解，使其達(dá)到即可抗老化，提高食用品質(zhì)，又能保有玉米淀粉凝膠結(jié)構(gòu)性質(zhì)。綜合考慮下，控制發(fā)酵至第3 d，對(duì)玉米粉品質(zhì)性質(zhì)具有最適的改良效果。

圖3 發(fā)酵對(duì)玉米粉淀粉消化率影響Fig.3 Effect of fermentation time on digestive properties of corn flour

3 結(jié)論

蛹蟲草可顯著降解玉米淀粉，提高直鏈淀粉含量，慢消化淀粉和抗性淀粉也隨之增加，發(fā)酵玉米粉具有更高的抗消化性；經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后，玉米粉的水溶指數(shù)增加而吸水指數(shù)降低；固態(tài)發(fā)酵可顯著降低玉米粉糊化的回生值和凝膠硬度（P<0.05），發(fā)酵玉米粉具有較好的抗老化性。綜合考慮下，發(fā)酵至第3 d的玉米粉，具有最佳的改良效果。本研究結(jié)果為蛹蟲草在玉米主食制品品質(zhì)改良方面提供一定參考。后續(xù)對(duì)蛹蟲草降解玉米淀粉，對(duì)淀粉結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行分析，進(jìn)一步從淀粉分子結(jié)構(gòu)角度解釋對(duì)淀粉的水解機(jī)制。