呂磊磊，周丹鳳，陳林杰，魏培蓮

（浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州 310023）

聚蘋果酸（Poly malic acid，PMA）最早是由Shimada等[1]從圓弧青霉菌（Penicillium cyclopium）中分離得到，現(xiàn)已被確定是一種無毒性、具有生物可降解性和生物相容性的水溶性聚酯類高分子材料[2?6]，在生物材料[7?8]、醫(yī)藥載體[9?11]等方面極具市場前景。PMA由L-蘋果酸單體組成，具有3種構(gòu)型：α型、β型、γ型，而微生物合成的PMA只有β型[12?13]。目前PMA的制備通常采用化學(xué)合成法或微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法可以得到3種構(gòu)型的PMA，但材料來源單一，能耗高，對設(shè)備要求嚴(yán)格，無法滿足綠色制造的要求[14?15]；而生物發(fā)酵生產(chǎn)PMA具有條件溫和、產(chǎn)物純度和分子量較高等優(yōu)點(diǎn)，且能使用可再生資源，符合綠色環(huán)保理念，目前備受國內(nèi)外研究人員的關(guān)注[16?17]。

現(xiàn)有研究表明短梗霉、環(huán)狀青霉和多頭絨泡菌等菌株都可以用于發(fā)酵制備PMA[18]，其中短梗霉不僅形態(tài)穩(wěn)定，易于實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程中的有效調(diào)控，其合成PMA的能力也高于其他菌種[19]。短梗霉屬存在4個變種[20]，分別是：A. pullulans，A. melanogenum，A. subglaciale和A. namibiae，其中A. pullulans是生產(chǎn)PMA的主要菌種。目前PMA的生產(chǎn)菌種由于發(fā)酵周期較長、單位時間內(nèi)產(chǎn)量較低、生產(chǎn)成本偏高等因素，微生物發(fā)酵制備PMA還未見成功商業(yè)化應(yīng)用的報(bào)道。通過自然篩選或遺傳改造來獲得高產(chǎn)菌株是提高PMA發(fā)酵產(chǎn)量、實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵制備PMA的有效手段。已有一些研究者開展了這方面的工作，獲得了一些高產(chǎn)菌[17?18,21]。本研究擬從自然界取樣進(jìn)行PMA高產(chǎn)菌的分離篩選工作，以期獲得PMA的高產(chǎn)菌株，為PMA的工業(yè)化生產(chǎn)提供新的菌種來源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

采樣樣本：花（編號Ⅰ-1～15）、土壤（編號Ⅱ-1～10）、樹葉（編號Ⅲ-1～20）、草葉（編號Ⅳ-1～15），共計(jì)60個 均取自校園及周邊；L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品 純度>99%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸 純度95%～98%，無水乙醇 純度≥99.7%，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；乙腈 色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；培養(yǎng)基配方所用藥品和試劑 均為分析純；菌種保藏培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA））：馬鈴薯粉 0.6%，葡萄糖 2%，瓊脂 2%；富集培養(yǎng)基：甘露醇10%，NH4NO30.1%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 0.02%，檸檬酸 0.2%，Span 80 0.02%；分離培養(yǎng)基（含氯霉素PDA）：馬鈴薯粉 0.6%，葡萄糖 2%，瓊脂 2%，氯霉素 0.01%；種子培養(yǎng)基：葡萄糖 5%，蛋白胨0.1%，酵母提取物 0.1%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.04%，NaCl 0.1%；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 12% ，NH4NO30.1%，KH2PO40.01%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.02%，CaCO33%（單獨(dú)滅菌，接種前加入）。

YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；生化恒溫培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；SKY-2102C恒溫培養(yǎng)搖床上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；BA310T生物顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；SU1510掃描電鏡 日立高新技術(shù)公司；TDZ4-WS臺式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；e2695高效液相色譜儀美國Waters。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高產(chǎn)PMA菌株的篩選 分離篩選流程如下：自然界取樣→富集培養(yǎng)→涂布分離→劃線純化→離心管發(fā)酵初篩→搖瓶發(fā)酵復(fù)篩→斜面保藏

1.2.1.1 富集與菌落分離純化 將適量樣品剪碎后置于裝有10 mL富集培養(yǎng)基的30 mL離心管中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2～3 d，直至培養(yǎng)液中有明顯渾濁出現(xiàn)；將培養(yǎng)液震蕩搖勻后，取1 mL菌液適當(dāng)稀釋后，移取100 μL稀釋液于分離培養(yǎng)基上涂布，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。定期觀察平板菌落生長情況，根據(jù)菌落形態(tài)特征選擇單菌落，進(jìn)行平板劃線純化。如果一個平板上生長有多個類似目的菌落，則用a、b等加以區(qū)別，如1a、1b。

1.2.1.2 離心管發(fā)酵初篩 從分離平板挑取純化后單菌落于裝有15 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的50 mL離心管中，28 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)7 d后，取發(fā)酵液檢測，有PMA產(chǎn)生的作為初篩目標(biāo)菌株。1

.2.1.3 搖瓶發(fā)酵復(fù)篩 取初篩目標(biāo)菌株的單菌落于PDA斜面上，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d后，取2環(huán)于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28 ℃、180 r /min搖床培養(yǎng)2 d，再以6%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)7 d，測定發(fā)酵液中PMA產(chǎn)量，以產(chǎn)量較高的菌株為復(fù)篩目標(biāo)菌株，并做進(jìn)一步研究。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的分析鑒定

1.2.2.1 有機(jī)溶劑法定性檢測PMA 在初篩研究中采用乙醇沉淀法[22]對發(fā)酵液中的PMA進(jìn)行定性檢測分析。參考已有研究[23]，將發(fā)酵液4000 r/min離心15 min后，取上清液加入2.8倍體積無水乙醇，立即觀察到有明顯絮狀沉淀產(chǎn)生或者溶液離心后有沉淀產(chǎn)生，即說明發(fā)酵液中有PMA生成，通過觀察沉淀生成情況，可初步判斷菌株產(chǎn)PMA的能力。

1.2.2.2 高效液相色譜法鑒定PMA 目前主要是將聚蘋果酸水解為L-蘋果酸單體進(jìn)行檢驗(yàn)測定，通過檢測水解前后發(fā)酵液中L-蘋果酸含量的變化，一方面確定發(fā)酵液中含有PMA，另一方面是以L-蘋果酸的濃度換算獲得PMA的濃度。

復(fù)篩研究中采用高效液相色譜法（HPLC）對目標(biāo)菌株的發(fā)酵液進(jìn)行測定，方法參考文獻(xiàn)[24?25]。樣品處理方法：將復(fù)篩目標(biāo)菌株的發(fā)酵液在4000 r/min條件下離心15 min，取上清液兩份，其中一份加入等體積1 mol/L H2SO4，90 ℃水浴水解9 h。上清液和水解液各稀釋20倍，用0.22 μm微孔濾膜過濾，置于進(jìn)樣瓶中，用于L-蘋果酸的HPLC檢測。

HPLC條件：色譜柱Hypersil ODS C18柱（4.6 mm×250 mm 2.5 μm），紫外檢測器（檢測波長210 nm），柱溫25 ℃，進(jìn)樣量50 μL。采用等度洗脫方式，流動相A為乙腈，流動相B為0.025 mol/L的KH2PO4緩沖溶液（pH 2.5），流速為 1.0 mL /min。

式中：CPMA表示PMA濃度，g/L；0.864表示L-蘋果酸與PMA的換算系數(shù)，ΔC蘋果酸表示酸水解前后L-蘋果酸的濃度差值，g/L。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)特征鑒定 a.顯微形態(tài)觀察：取液體培養(yǎng)1 d的菌液100 μL制片，若菌體濃度過大，適當(dāng)稀釋后，再取100 μL制片。在顯微鏡的視野里隨機(jī)選取單細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，并拍照記錄菌體形態(tài)。

b.掃描電鏡觀察[27]：取液體培養(yǎng)2 d的菌液，4000 r/min離心15 min后倒去上清液，沉淀用適量5%戊二醛處理12 h；4000 r/min離心5 min后，將沉淀細(xì)胞用不同濃度梯度的乙醇（10%、20%、30%、50%、70%、90%、100%）進(jìn)行脫水處理，每次脫水10 min；脫水完成后于40 ℃烘箱中烘干乙醇，再用棉簽蘸取少量樣品，鋪在載物臺導(dǎo)電膠上，噴金，電鏡觀察。

1.2.3.2 分子鑒定 菌種分子鑒定委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。按照生工SK8259真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書，對鑒定菌種的細(xì)胞DNA進(jìn)行提取，引物設(shè)計(jì)如下：

上游引物（ITS1）：5′TCCGTAGGTGAACCT GCGG 3′ (19 bp)

下 游 引 物（ITS4）：5′TCCTCCGCTTATTGA TATGC 3′ （20 bp）

PCR 25 μL反應(yīng)體系設(shè)計(jì)如表1所示：

表1 PCR反應(yīng)體系Table 1 The reaction system of PCR

PCR擴(kuò)增條件如表2所示：

表2 PCR擴(kuò)增條件Table 2 The amplification conditions of PCR

用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，按生工SK8131 DNA膠回收試劑盒說明書純化回收PCR產(chǎn)物，由委托公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，搜索與其同源性高的基因序列，用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌種分類，最后由Banklt向NCBI提交基因序列，申請基因編號。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016作表，MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種初篩結(jié)果

富集培養(yǎng)后，在分離培養(yǎng)基上經(jīng)劃線分離共獲得36個單菌落。對所有單菌落進(jìn)行離心管發(fā)酵培養(yǎng)，采用乙醇沉淀法檢測是否有PMA產(chǎn)生（圖1）。經(jīng)初篩得到21株產(chǎn)PMA菌株，通過觀察沉淀情況，初步判斷編號Ⅰ-2、Ⅰ-13a、Ⅲ-16菌株的產(chǎn)PMA能力較強(qiáng)（表3）。

圖1 乙醇沉淀結(jié)果Fig.1 Results of ethanol precipitation

2.2 菌株復(fù)篩結(jié)果

對初篩中產(chǎn)PMA的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，HPLC測定發(fā)酵液中的PMA，結(jié)果見表4。從結(jié)果可以看出，分離自樣本編號為I-13a的菌株產(chǎn)量最高，PMA產(chǎn)量達(dá)到（43.08±0.36） g/L。

表4 菌株復(fù)篩結(jié)果Table 4 The results of secondary screening

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物分析鑒定

對L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和水解前后的發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果顯示（圖2）L-蘋果酸的平均保留時間為3.190 min，RSD為1.11%，水解前后的樣品目的峰與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間一致，且發(fā)酵液經(jīng)水解后L-蘋果酸的濃度大幅度升高（圖3、圖4），說明發(fā)酵液中含有L-蘋果酸的聚合物。

圖2 L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of L-malic acid standard solution

2.4 高產(chǎn)菌株的鑒定

圖3 水解前發(fā)酵液的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of fermentation broth before hydrolysis

圖4 水解后發(fā)酵液的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of fermentation broth after hydrolysis

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 對篩選出的高產(chǎn)PMA菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。編號I-13a菌株在分離平板上的菌落生長初期為淺粉色，外表有光澤，菌落邊緣呈現(xiàn)明顯根狀（圖5a），菌落生長后期逐漸變綠變暗，最終呈黑色皮革狀；菌體細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下呈卵圓形，大小相近，呈出芽方式增殖（圖5b）；在掃描電鏡下菌體細(xì)胞也呈現(xiàn)明顯的卵圓形，酵母樣，單個存在，大小為（20～30） μm×（40～50） μm（圖5c）。以上特征都與典型的短梗霉特征相似。

圖5 編號I-13a菌株的形態(tài)觀察結(jié)果Fig.5 Morphological observation results of strain I-13a

2.4.2 高產(chǎn)菌株的分子鑒定 提取編號Ⅰ-13a菌株的基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后回收測序，所測菌株ITS核苷酸序列長度為560 bp，電泳結(jié)果如圖6所示。將該序列提交到NCBI上進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)編號Ⅰ-13a菌株與Aureobasidium melanogenum的同源性最高，采用Neighbor-joining法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7），再結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，確定編號Ⅰ-13a菌株屬于Aureobasidium melanogenum，并命名為ZUST-HD，GenBank庫登錄號為MK754072.1。

圖6 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.6 The result of agarose gel electrophoresis

圖7 基于編號Ⅰ-13a菌株基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree based on gene sequence of strain Ⅰ-13a

3 結(jié)論與討論

本研究建立了富集培養(yǎng)、平板分離、離心管發(fā)酵初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩的分離篩選方法。經(jīng)大量篩選獲得了一株P(guān)MA高產(chǎn)菌，產(chǎn)量達(dá)到（43.08±0.36） g/L。該菌株經(jīng)初步鑒定屬于Aureobasidium melanogenum。

已有文獻(xiàn)報(bào)道中PMA的生產(chǎn)菌主要為Aureobasidiumpullulans[18,21,28]，Aureobasidium melanogenum相對較少。Aureobasidium melanogenum在生長過程中可產(chǎn)生一定量的黑色素，廣泛用于普魯蘭糖、黑色素、liamocin等的生產(chǎn)[29?31]。一般來說，黑色素的產(chǎn)生會影響菌株P(guān)MA的發(fā)酵產(chǎn)量和后期分離純化，但通過發(fā)酵過程中的代謝調(diào)節(jié)調(diào)控等手段可以限制副產(chǎn)物黑色素的生成，使得Aureobasidium melanogenum在生產(chǎn)PMA方面也有良好的研究應(yīng)用[32]。目前文獻(xiàn)報(bào)道中PMA搖瓶發(fā)酵的產(chǎn)量多為26～30 g/L，通過發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵、重復(fù)批次發(fā)酵等手段，可使產(chǎn)量進(jìn)一步提高到50～110 g/L[33]。本研究所獲得的菌種初步搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為（43.08±0.36） g/L，高于大多數(shù)已報(bào)道菌株，經(jīng)后期的培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝改進(jìn)產(chǎn)量還有望得到大幅度提高。該菌株在生產(chǎn)普魯蘭多糖和liamocin方面的能力也有待進(jìn)一步探究。