李 冉，朱和源，葉可萍，周光宏，李春保

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（南京）/江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210095）

即食肉制品是指經(jīng)過部分或完全熟制，不需烹調(diào)或只需簡單加熱就能食用的肉制品[1?2]。即食肉制品包括高熱處理和低熱處理的非腌制和腌制肉制品[3]。獅子頭作為一種傳統(tǒng)的中式即食肉制品，其制作方法與地理區(qū)域有關(guān)[4?5]，因其獨特的風(fēng)味和良好的口感而受到全世界的歡迎[6?8]。然而，獅子頭中較高的水分活度和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)能夠促進(jìn)微生物生長繁殖，縮短了獅子頭的貨架期[9?11]。目前市售的獅子頭主要采用彩袋或塑料袋等相對簡單的包裝方式，較短的貨架期嚴(yán)重制約著獅子頭的銷售流通和傳播發(fā)展。

氣調(diào)包裝技術(shù)的原理是通過合適的氣體組成替換包裝內(nèi)的氣體環(huán)境，并利用包裝材料的阻氣性和透氣性，使食品始終處于穩(wěn)定的適宜氣體環(huán)境中，以抑制微生物的生長繁殖，從而達(dá)到延長貨架期的目的[12?13]。其中，CO2和N2的混合氣體因能抑制大多數(shù)微生物生長而特別適合保存熟肉和腌制肉[14]。目前關(guān)于氣調(diào)包裝在肉及肉制品中的研究主要集中在即食肉制品方面，如牛排[15]、鹵雞[16]、黃燜雞[17]、醬鹵鴨食管[18]等肉制品。梁榮蓉等[17]研究發(fā)現(xiàn)在100% N2和80% N2+20% CO2這兩種包裝參數(shù)下，黃燜雞產(chǎn)品在冷藏條件下（0～4 ℃）的貨架期能達(dá)到28 d，并維持了較好的品質(zhì)特性和感官特性。然而目前關(guān)于氣調(diào)技術(shù)在獅子頭中的應(yīng)用研究鮮有報道，因此本實驗選取獅子頭作為研究對象，探究其在氣調(diào)包裝貯藏過程中微生物數(shù)量的變化情況，以期通過優(yōu)化氣體比例延長獅子頭的貨架期。

高通量測序技術(shù)既能完整覆蓋微生物群落，還可根據(jù)數(shù)百萬序列對每個樣本中單個操作分類單元的數(shù)量進(jìn)行定量估計，被證明是能精確鑒定微生物種類的有效手段[12,19]。Li等[20]研究結(jié)果表明：腸膜明串珠菌、清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌、沙雷菌屬、拉恩氏菌屬、乳球菌屬、梭桿菌屬可能是引起培根腐敗的優(yōu)勢菌屬。目前高通量測序技術(shù)在菌群結(jié)構(gòu)的研究方面主要集中在生鮮肉和西式熟肉制品中，鮮有高通量測序技術(shù)應(yīng)用于氣調(diào)包裝傳統(tǒng)中式即食肉制品的微生物多樣性分析，通過高通量測序技術(shù)鑒定腐敗時期氣調(diào)包裝中式傳統(tǒng)即食肉制品的菌群結(jié)構(gòu)，能夠為該類產(chǎn)品的微生物控制提供理論基礎(chǔ)。

本實驗以獅子頭為研究對象，以獅子頭原有包裝（彩袋包裝）作為對照，研究了三種氣調(diào)包裝處理100% N2、30% CO2+70% N2、40% CO2+60% N2對獅子頭在0～4 ℃下貯藏期間微生物品質(zhì)的變化規(guī)律，并采用高通量測序技術(shù)研究3種氣調(diào)包裝組獅子頭腐敗時的菌群結(jié)構(gòu)，探究氣調(diào)包裝對獅子頭微生物數(shù)量的影響及鑒定氣調(diào)包裝獅子頭腐敗時期的菌群結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步延長氣調(diào)包裝獅子頭的貨架期提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獅子頭 取自江蘇省淮安市蘇食肉品有限公司；氣調(diào)包裝托盤包裝盒（尺寸224 mm×133 mm×40 mm，透氧率≤10 mL/（m2·d）（23 ℃, 0.1 MPa），水蒸氣透過率≤15 g/（24 h·m2）（38 ℃，90% RH））、Lid 1050/550Lidstock塑封包裝膜（厚度25.0 μm; 主要材質(zhì)線性低密度聚乙烯，拉伸強(qiáng)度：縱向105 MPa，橫向92.9 MPa；透氧率：4.4 ℃、100% RH條件下低于20.0 mL/（m2·d），4.4 ℃、0% RH條件下低于6.0 mL/（m2·d），22.8 ℃、0% RH條件下低于5.0 mL/（m2·d）；水蒸氣透過率≤1.0 g/（24 h·m2）（4.4 ℃、100% RH）；推薦使用溫度15～32 ℃） 美國希悅爾公司；平板計數(shù)瓊脂（PCA）、乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA） 北京陸橋；假單胞菌選擇性培養(yǎng)基（CFC）、無菌均質(zhì)袋 青島海博；氯化鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；土壤DNA基因組提取試劑盒（Omega Biotek公司）、膠回收試劑盒Axygen生物科技公司。

OXYBABY6.0氣體成分分析儀 上海眾林機(jī)電設(shè)備有限公司；BagMixer400VW拍擊式均質(zhì)器法國Interscience公司；SMART500氣調(diào)包裝機(jī) 西班牙ULMA公司；HPP260恒溫恒濕箱 德國Memmert公司；ABI GeneAmp? PCR儀 美國ABI公司；QuantusTMFluorometer熒光定量系統(tǒng)美國Promega公司；Illumina Miseq測序儀 美國Illumina公司；Scan1200自動影像分析菌落計數(shù)儀法國Interscience公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集、包裝與貯藏 從江蘇省淮安市蘇食肉品有限公司采集200袋新鮮（初始樣品為180 g/袋的彩袋密封包裝）的獅子頭置于冰盒中，3 h內(nèi)運至實驗室。當(dāng)樣品到達(dá)實驗室時，將樣品隨機(jī)分配和包裝在三種氣體環(huán)境中：Group A：30% CO2+70% N2、Group B：40% CO2+60% N2、Group C：100% N2。所有的樣品貯藏在4 ℃的恒溫恒濕箱中，取樣時間點為：0、3、6、9、12、15、18 d，每組樣品設(shè)置三個重復(fù)。

1.2.2 包裝袋頂空氣體比例的測定 參考Guo等[21]的方法并稍作修改，通過Oxybaby 6.0i 氣體成分分析儀測定三組獅子頭包裝內(nèi)的頂空氣體組成。將氣體比例測定儀的探頭插入不同處理組的氣調(diào)包裝盒中，氣調(diào)包裝盒內(nèi)頂空CO2以及O2的含量顯示在測定儀的屏幕上。

1.2.3 獅子頭微生物數(shù)量的測定 菌落總數(shù)的測定參照GB4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》方法進(jìn)行；在無菌環(huán)境下從每組樣品中隨機(jī)剪取25 g肉樣，剪碎放入含225 mL滅菌生理鹽水（0.85%）的無菌采樣袋中，采樣袋在均質(zhì)器中中速均質(zhì)2 min，隨后按照10倍梯度稀釋到所需要的稀釋度。從稀釋液中選取合適的梯度，取1 mL稀釋液置于無菌培養(yǎng)皿中，倒入15 mL左右的PCA培養(yǎng)基，混合均勻后冷卻至培養(yǎng)基凝固，將凝固的培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h計數(shù)。取1 mL稀釋液置于無菌培養(yǎng)皿中，倒入15 mL左右的CFC培養(yǎng)基，混合均勻后冷卻至培養(yǎng)基凝固，將凝固的培養(yǎng)基置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h計數(shù)。取1 mL稀釋液置于無菌培養(yǎng)皿中，倒入15 mL左右的VRBGA培養(yǎng)基，混合均勻后冷卻至培養(yǎng)基凝固，將凝固的培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h計數(shù)。微生物數(shù)量以lg（CFU/g）表示。

1.2.4 DNA提取及高通量測序 參考趙嘉越等[14]的方法并做適當(dāng)?shù)男薷?，選取腐敗時的樣品提取細(xì)菌總DNA并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。對細(xì)菌的16S rDNA的V3-V4區(qū)設(shè)計特異引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特異性引物為338F（5’-ACTCCTACG GGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3’），PCR反應(yīng)體系為：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游和下游引物（5 μmol/L）各0.8 μL，F(xiàn)astPfu DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.4 μL，模板DNA 10 ng，重蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：98 ℃預(yù)變性2 min，進(jìn)入熱循環(huán)；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個循環(huán)；最后一個延伸為72 ℃、5 min。將PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，并用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量，將PCR產(chǎn)物通過Illumina MiSeq PE250平臺進(jìn)行DNA測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

顯著性差異分析使用SAS軟件的Duncan’s多重比較進(jìn)行分析，當(dāng)P<0.05時認(rèn)為有顯著性差異；當(dāng)P<0.01時認(rèn)為有極顯著性差異。采用GraphPad Prism 5軟件繪圖。將Illumina PE250測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行物種分類學(xué)分析，基于分類學(xué)信息，可以在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 獅子頭貯藏過程中包裝內(nèi)頂空CO2和O2含量變化

由圖1可知，貯藏過程中，氣調(diào)包裝處理組的頂空CO2含量波動變化，而對照組的頂空CO2含量穩(wěn)定不變。這可能是處理組和對照組之間微生物代謝活動不同導(dǎo)致的。30% CO2+70% N2在前6 d的貯藏過程中，頂空CO2含量不斷減少，第9 d時CO2含量迅速增加然后不斷減少。在前12 d的貯藏過程中，40% CO2+60% N2的頂空CO2含量不斷減少，隨后略有增加，在貯藏末期時降至30%。100% N2在第6 d時，頂空CO2含量突然增加，在第9 d時達(dá)到最大值，在貯藏末期頂空CO2含量不斷減少，直至接近0。氣調(diào)包裝處理組的氧氣含量始終為0，而對照組中的氧氣含量不斷減少。這是因為存在于肉制品中的細(xì)菌主要為好氧菌或兼性厭氧菌，細(xì)菌在生長代謝過程中會不斷消耗氧氣，從而導(dǎo)致對照組頂空內(nèi)的氧氣含量不斷減少。

2.2 獅子頭貯藏過程中微生物數(shù)量變化

圖1 獅子頭貯藏過程中包裝內(nèi)頂空CO2和O2含量變化圖Fig.1 Changes of CO2 and O2 contents in headspace of packages during storage

圖2 獅子頭貯藏過程中微生物數(shù)量的變化圖Fig.2 Changes of the microbial counts in meatballs during storage

在貯藏過程中，樣品中菌落總數(shù)、假單胞菌（Pseudomonas）數(shù)、腸桿菌（Enterobacteriaceae）數(shù)的變化情況如圖2所示。樣品包裝后的初始菌落總數(shù)在3.5（lg（CFU/g））左右，在貯藏過程中，樣品的菌落總數(shù)隨著貯藏時間的增加而增加。貯藏15 d時，30% CO2+70% N2組和40% CO2+60% N2的菌落總數(shù)顯著低于對照組（P<0.05），40% CO2+60% N2的菌落總數(shù)顯著低于30% CO2+70% N2組（P<0.05），而100% N2組與對照組的菌落總數(shù)沒有顯著性差異（P>0.05）。在15 d時，30% CO2+70% N2組、100%N2組以及對照組的菌落總數(shù)超過6 lg，而40%CO2+60% N2的菌落總數(shù)仍在6 lg范圍之內(nèi)。我國《NYT 2073-2011調(diào)理肉制品加工技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定的菌落總數(shù)最高安全限量為6（lg（CFU/g））（4 ℃條件下），說明15 d時，30% CO2+70% N2組、100%N2組和對照組的樣品已經(jīng)完全腐敗。18 d時，40%CO2+60% N2組的菌落總數(shù)在6 lg范圍內(nèi)，因此40% CO2+60% N2組能夠?qū)ⅹ{子頭的貨架期延長3 d。對于假單胞菌來說，貯藏3～18 d時，30% CO2+70% N2組和40% CO2+60% N2的假單胞菌數(shù)均顯著低于對照組和100% N2組（P<0.05），而100%N2組與對照組的假單胞菌數(shù)沒有顯著性差異（P>0.05）。40% CO2+60% N2組的腸桿菌數(shù)在貯藏末期顯著低于30% CO2+70% N2組，100% N2組和對照組（P<0.05），而30% CO2+70% N2組，100%N2組和對照組的腸桿菌數(shù)在貯藏末期沒有顯著性差異（P>0.05）。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，氣調(diào)包裝技術(shù)的抑菌作用隨著CO2含量的增加而增強(qiáng)。氣調(diào)包裝是在包裝中充入CO2、O2和N2等保護(hù)氣體來抑制食品中微生物的生長繁殖，從而延長食品貨架期的一種綠色包裝方式[22]。其中，CO2是使氣調(diào)包裝具有抑菌作用的重要氣體成分，CO2溶于水形成的碳酸能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，降低胞內(nèi)pH并裂解細(xì)胞，最終抑制微生物的代謝活動[13]。

2.3 氣調(diào)包裝獅子頭優(yōu)勢腐敗菌的分析

圖3 腐敗時期氣調(diào)包裝獅子頭門水平（a）和屬水平（b）細(xì)菌群落分析Fig.3 Analysis of the bacterial community at the phyla level（a）and at the genus level（b）of the modified atmosphere packaging meatballs during spoilage period

從2.2的微生物結(jié)果可知：40% CO2+60% N2組在菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)、腸桿菌數(shù)以及乳酸菌屬上的抑菌效果優(yōu)于30% CO2+70% N2組和100% N2組，在18 d時，三個處理組樣品均已接近腐敗，而18 d的貯藏期限嚴(yán)重縮小了獅子頭的銷售和流通范圍，制約了企業(yè)在調(diào)理肉制品領(lǐng)域的經(jīng)濟(jì)效益。因此，實驗選取貯藏末期的氣調(diào)包裝獅子頭測定其菌群結(jié)構(gòu)，從而為優(yōu)勢腐敗菌的篩選提供參考，最終選取合適的殺菌技術(shù)來靶向抑制優(yōu)勢腐敗菌的生長繁殖，延長獅子頭的貨架期。圖3表示貯藏末期三個處理組的菌群結(jié)構(gòu)，在門水平上，三個處理組的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）。其中厚壁菌門在100% N2組、30% CO2+70% N2組和40% CO2+60% N2組的豐度值分別為19.75%、32.69%、32.13%。變形菌門在100% N2組、30%CO2+70% N2組和40% CO2+60% N2組的豐度值分別為12.38%、7.24%、13.28%。在屬水平上，三個處理組的菌群結(jié)構(gòu)主要由芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）、假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）、鏈球菌屬（Streptococcusspp.）、不動桿菌屬（Acinetobaceterspp.）、熱殺索絲菌屬（Brochothrixspp.）、腸桿菌屬（Enterobacterspp.）、乳酸菌屬（Lactobacillusspp.）以及嗜冷桿菌屬（Psychrobacterspp.）組成。其中芽孢桿菌屬在100% N2組、30% CO2+70% N2組和40% CO2+60% N2組的豐度值分別為11.69%、27.27%、26.56%。假單胞菌屬在100% N2組、30%CO2+70% N2組和40% CO2+60% N2組的豐度值分別為6.16%、2.18%、3.36%。鏈球菌屬在100%N2組、30% CO2+70% N2組和40% CO2+60% N2組的豐度值分別為4.39%、3.04%、3.68%。不動桿菌屬在100% N2組、30% CO2+70% N2組和40% CO2+60% N2組的豐度值分別為1.46%、3.04%、1.51%。熱殺索絲菌屬在100% N2組、30% CO2+70% N2組和40% CO2+60% N2組的豐度值分別為2.52%、0.67%、0.98%（圖4）。

3 討論

圖4 腐敗時期氣調(diào)包裝獅子頭優(yōu)勢腐敗菌的組成圖Fig.4 Composition of dominant spoilage bacteria in modified atmosphere packaging meatballs during spoilage period

貯藏過程中，氣調(diào)包裝處理組的頂空CO2含量波動變化，而對照組的頂空CO2含量穩(wěn)定不變。這可能是由于處理組和對照組之間微生物代謝活動不同的緣故。Ye等[23]研究發(fā)現(xiàn)貯藏過程中頂空CO2含量在鹵鴨翅包裝中波動變化，這與本研究結(jié)果一致。但Zhai等[24]比較鹽水鴨在氣調(diào)包裝和正常包裝條件下的貨架期時發(fā)現(xiàn)，樣品包裝內(nèi)頂空CO2含量在貯藏過程中不斷減少，這與本研究結(jié)果不同。這可能是由于樣品差異導(dǎo)致貯藏過程中頂空CO2含量在不同樣品中變化規(guī)律不同的緣故。具體機(jī)理有待于今后進(jìn)一步探討。

本研究發(fā)現(xiàn)：在貯藏末期，30% CO2+70% N2組和40% CO2+60% N2組的菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)均顯著低于對照組（P<0.05），這與之前的研究結(jié)果一致[15]。40% CO2+60% N2組的菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)、乳酸菌數(shù)顯著低于30% CO2+70% N2組（P<0.05），這說明包裝中CO2含量越高，抑菌效果越好。張新笑等[12]在研究不同CO2比例氣調(diào)對冷鮮雞肉中熒光假單胞菌的抑制作用時發(fā)現(xiàn)：熒光假單胞菌總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮和腐胺含量隨著貯藏時間延長而上升，隨二氧化碳體積分?jǐn)?shù)的升高而下降，這與我們的研究結(jié)果一致。但Sivertsvik[25]研究認(rèn)為：當(dāng)CO2含量超過50%時，肉類包裝在儲藏過程中會出現(xiàn)凹陷，降低產(chǎn)品的外觀可接受度。

對腐敗時三組氣調(diào)包裝樣品進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)三個處理組菌群結(jié)構(gòu)主要由芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）、假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）、鏈球菌屬（Streptococcusspp.）、不動桿菌屬（Acinetobaceterspp.）、熱殺索絲菌屬（Brochothrixspp.）、腸桿菌屬（Enterobacterspp.）、乳酸菌屬（Lactobacillusspp.）以及嗜冷桿菌屬（Psychrobacterspp.）組成。張志剛等[26]在分析低溫獅子頭冷藏過程中的品質(zhì)變化規(guī)律時發(fā)現(xiàn)：冷藏末期獅子頭中的優(yōu)勢菌群為梭狀芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬，這與本研究結(jié)果一致。其他菌屬也曾在多種氣調(diào)包裝肉制品的菌群結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)，如氣調(diào)包裝（70% O2+30% N2）鹽水鵝的菌群結(jié)構(gòu)由假單胞菌（52.5%）、腸桿菌（31.1%）和熱殺索絲菌（12.4%）構(gòu)成[27]。氣調(diào)包裝（25%CO2+75% N2）醬鹵鴨食管的優(yōu)勢腐敗菌主要有副黃假單胞菌、特基拉芽孢桿菌、肉芽腫克雷伯氏菌和香坊腸桿菌[16]。氣調(diào)包裝（30% CO2+70% O2）生香腸的優(yōu)勢腐敗菌主要有熱殺索絲菌、乳酸菌等菌屬[4]。

芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）、假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）、腸桿菌屬（Enterobacterspp.）、熱殺索絲菌屬（Brochothrixspp.）經(jīng)常在包裝肉制品的腐敗末期檢測到，在多篇研究中證明參與肉制品的腐敗過程，出現(xiàn)異味[28]、脹袋[29]、變色[30]等感官缺陷。最近的研究表明，不動桿菌屬（Acinetobaceterspp.）是食品服務(wù)環(huán)境中的主要微生物種類之一，如預(yù)處理表面、儲藏間和廚房等[31]，這可能是氣調(diào)包裝樣品中貯藏末期不動桿菌屬豐度高的原因。Esmer[32]、Gill等[33]研究證實，假單胞菌屬是肉及肉制品中主要優(yōu)勢腐敗菌屬，它通過利用肉及肉制品中的葡萄糖和蛋白質(zhì)，加速其自身的增殖和代謝，從而產(chǎn)生具有異味的含硫化合物、酯類和酸類。雖然假單胞菌屬是好氧菌，但在多篇研究中證實了假單胞菌屬在無氧的氣調(diào)環(huán)境下能夠生長繁殖[32]。芽孢桿菌是一種常見的革蘭氏陽性菌，其中部分好氧菌或兼性厭氧菌可以利用蛋白質(zhì)、多糖及淀粉，分解色氨酸形成具有異味的揮發(fā)性化合物。

4 結(jié)論

與對照組相比，30% CO2+70% N2和40% CO2+60% N2氣調(diào)包裝組能夠抑制獅子頭貯藏過程中菌落總數(shù)、假單胞菌屬、腸桿菌屬的生長繁殖，其中40%CO2+60% N2組在獅子頭貯藏過程中微生物的控制方面效果更加明顯。高通量測序技術(shù)鑒定獅子頭貯藏末期的菌群結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，三個處理組的菌群結(jié)構(gòu)主要由芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）、假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）、鏈球菌屬（Streptococcusspp.）、不動桿菌屬（Acinetobaceter spp.）、熱殺索絲菌屬（Brochothrixspp.）、腸桿菌屬（Enterobacterspp.）、乳酸菌屬（Lactobacillusspp.）以及嗜冷桿菌屬（Psychrobacterspp.）組成。Lefse差異分析表明三個處理組之前的菌群結(jié)構(gòu)沒有顯著差異。本研究結(jié)果為企業(yè)開發(fā)延長氣調(diào)包裝獅子頭貨架期技術(shù)提供參考。