楊飛艷，羅 章，謝司偉，劉春愛，黃文陽，孫術(shù)國,

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長沙 410004；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000）

牦牛（Bos grunniens）是牛屬類比較優(yōu)秀的品種之一，可以在極端惡劣環(huán)境生存，如高海拔（2500～5000 m）、低氧和低溫（?40 °C）等[1]。在中國，牦牛乳的經(jīng)濟重要性僅次于奶牛乳和水牛乳，是藏族居民必不可少的飲食[2]。牦牛乳含有多種主要營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、鈣、維生素、脂肪、必須氨基酸、乳糖以及微量元素等[3?4]。奶渣是由牦牛全乳提制酥油脫脂，經(jīng)熱處理后，再加入皺胃酶或酸奶進一步過濾、曬干而成，因水分含量低，易于保存[5?6]。牦牛奶渣具有較高含量的蛋白質(zhì)、氨基酸、鈣、鐵、維生素、乳糖等營養(yǎng)成分，較低含量脂肪[7?9]，營養(yǎng)豐富，可以直接食用，也可以作為輔料添加到其它食品使用，譬如糌粑、面包等，因而奶渣是藏族人民最喜愛的食品之一，也是藏族人民重要的食物蛋白來源，其市場潛力和發(fā)展前景廣闊。

然而，由于對奶渣營養(yǎng)、風(fēng)味品質(zhì)及其功能缺乏系統(tǒng)研究，特別是不同海拔牦牛奶源的差異，以及不同海拔、不同地區(qū)奶渣加工工藝的差異，造成不同海拔奶渣營養(yǎng)、風(fēng)味品質(zhì)及其功能也存在顯著差異，系統(tǒng)研究西藏不同海拔奶渣營養(yǎng)、風(fēng)味品質(zhì)及其功能特性，為奶渣合理利用和產(chǎn)品開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)?；诖耍緦嶒灁M以西藏三個不同海拔地區(qū)牦牛奶渣樣品為研究對象，分析其在營養(yǎng)、風(fēng)味、熱力學(xué)特性、流變學(xué)特性以及抗氧化活性等功能方面的差異，研究不同海拔對奶渣上述品質(zhì)的影響程度，以期為全面了解牦牛奶渣提供依據(jù)，對開發(fā)西藏地區(qū)少數(shù)民族特色乳制品具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛奶渣 選取西藏三個不同海拔地區(qū)的市售牦牛奶渣，將其標記為NA（海拔2500～2800 m奶渣）、NB（海拔3500～4000 m奶渣）、NC（海拔4300 m以上奶渣），為了降低選樣所造成的誤差，同一海拔奶渣原料購于5個不同的銷售點，為了降低系統(tǒng)誤差，采用樣品分別檢測和混合檢測相結(jié)合，所有結(jié)果求平均值，購置的奶渣置于?20 ℃保存?zhèn)溆?；無水硫酸銅、硫酸鉀（均為分析純） 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；氫氧化鈉、三氯化鐵、硫酸亞鐵、醋酸鈉、無水乙醇（均為分析純） 國藥集團；DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、Tris-HCL（TRIS hydrochloride，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）、鄰苯三酚、鄰菲羅啉、TPTZ（DLDithiothreitol，二硫代蘇糖醇） 美國Sigma公司。

MS105DU分析天平 島津儀器（蘇州）有限公司；RN 4.1哈克流變儀 德國Rheotest公司；DSC 200 F3差示掃描量熱儀 德國（耐馳）公司；7890B/7000CGC/MS串聯(lián)質(zhì)譜儀 安捷倫科技有限公司；2777C UPLC system高效液相色譜儀 美國Waters公司；L-89000氨基酸分析儀 日本日立公司；SZF-06C脂肪測定儀 上海洪紀儀器設(shè)備有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同海拔奶渣熱力學(xué)特性的測定 精確稱取3.0 mg樣品，置于鋁盒中，壓片。DSC牦牛奶渣的行為與溫度監(jiān)控掃描程序設(shè)置為以10 ℃/min的速率加熱至220 ℃，氮氣流速40 mL/min[10]。

1.2.2 不同海拔奶渣黏彈特性的測定 流變學(xué)特性參考馬曉靈等[11]方法，稍作修改。采用哈克流變儀測定奶渣的黏彈特性，將樣品添加至載物臺上，探頭與載物臺之間間隙保留1 mm，進行應(yīng)變掃描、頻率掃描測定。應(yīng)變掃描程序：采用振蕩模式，頻率固定為1 Hz，溫度為25 ℃，平衡時間為180 s，應(yīng)變變化范圍0.01%～100%。頻率掃描程序：采用振蕩模式，在應(yīng)變掃描的基礎(chǔ)上確定線性黏彈區(qū)并選定一個恒定應(yīng)變（0.25%），掃描頻率0.01～100 Hz，測定樣品的儲藏模量（G′）和損耗模量（G″）。

1.2.3 不同海拔奶渣主要營養(yǎng)成分的測定 氨基酸含量測定參照GB5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》；粗蛋白的測定參照GB/T5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》；灰分的測定參照GB/T5009.4-2016《食品中灰分的測定》；粗脂肪的測定參照GB/T5009.6-2016《食品中脂肪的測定》；水分的測定參照GB/T5009.3-2016《食品中水分的測定》；VA的測定參照GB/T5009.82-2016《食品中VA的測定》；VE的測定參照GB/T5009.82-2016《食品中VE的測定》；VD3的測定參照GB/T5009.82-2016《食品中VD3的測定》；磷的測定參照GB/T5009.87-2016《食品中磷的測定》；鈣的測定參照GB/T5009.268-2016《食品中鈣的測定》；鐵的測定參照GB/T5009.268-2016《食品中鐵的測定》。

1.2.4 不同海拔奶渣風(fēng)味成分的測定 應(yīng)用GCMS法測定不同海拔牦牛奶渣中揮發(fā)性成分的相對百分含量，并對比分析其揮發(fā)成分的差異[12]。

色譜柱：DB-5ms毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：初始溫度40 ℃，以10 ℃/min的速率升至250 ℃，保持2 min；進樣口和檢測器（MSD）溫度：250 ℃；EI，電子能量70 eV，燈絲發(fā)射電流200 μA，離子源溫度230 ℃，接口溫度：250 ℃。以全掃描的方式進行數(shù)據(jù)采集（載氣-氦氣（He）；流速?1 mL/min；壓力?11.567 psi和吹掃流量?50 mL/min；隔墊吹掃流量?3 mL/min）。

試驗數(shù)據(jù)處理由Xcalibur 軟件系統(tǒng)完成，由保留時間計算得到的保留指數(shù)（Rentention Index，RI）來對所檢測到的化合物進行定性分析，通過各化合物的峰面積歸一化進行定量分析計算其相對百分含量。

1.2.5 不同海拔奶渣抗氧化活性的測定

1.2.5.1 奶渣樣品液的制備 按奶渣樣品:水=1:4（w/v）的比例在37 ℃水解2 h，于4 ℃離心機離心20 min（12000 r/min），取上清得奶渣樣品液。

1.2.5.2 對DPPH自由基的清除作用 用無水乙醇配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液，取制備好奶渣樣品，將樣品和DPPH溶液混勻，于室溫下避光放置30 min后，在518 nm處測定吸光度A1，無水乙醇和DPPH溶液的吸光度為A0，樣品和無水乙醇的吸光度為A2平行測定3次，按下列公式計算清除率[13]。

樣品DPPH 自由基清除能力以每g樣品中當量Trolox的mmol量表示。

式中：c表示標曲讀數(shù)；100表示每100 g標準品中含有Trolox的量，mmol；n表示稀釋倍數(shù);m 表示奶渣質(zhì)量，g；V 表示反應(yīng)體系總體積，mL。

1.2.5.3 超氧陰離子自由基清除作用 用蒸餾水配制50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH=8.2），用0.01 mol/L的HCl配制0.3 mmol/L的鄰苯三酚溶液。自氧化速率V0的測定：在試管中加入5 mL Tris-HCl緩沖液，25 ℃恒溫水浴中放置20 min，再加入0.5 mL鄰苯三酚溶液，立即混勻倒入比色杯中，在325 nm處測定A值，每反應(yīng)30 s記錄一組，共反應(yīng)5 min。將記錄的數(shù)據(jù)以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，作直線回歸得到的斜率表示鄰苯三酚自氧化速率V0。奶渣樣品清除超氧陰離子速率V1的測定：在試管中加入5 ml Tris-HCl緩沖液，加入1 mL蒸餾水，1 mL奶渣樣品于25 ℃恒溫水浴中放置20 min，再加入0.5 mL鄰苯三酚溶液，立即混勻倒入比色杯中，在325 nm處測定A值，每反應(yīng)30 s記錄一組，共反應(yīng)5 min。將記錄的數(shù)據(jù)以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，做直線回歸得到的斜率表示奶渣樣品液清除超氧陰離子的速率V1。清除率計算公式為[14]：

1.2.5.4 羥基自由基清除作用 用蒸餾水配制pH=7.4、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，5 mmol/L的鄰菲羅啉，7.5 mmol/L的硫酸亞鐵以及1%的過氧化氫溶液。在試管中分別加入2 mL磷酸鹽緩沖液，0.3 mL鄰菲羅啉溶液，充分混勻后，加入0.2 mL FeSO4溶液，每加一管后立即混勻。然后向其中加入奶渣樣品液，混勻，再加入2 mL H2O2，最后補充體積至8 mL。另再做損傷管和未損傷管，其中損傷管中加入1 mL H2O2，未損傷管不加H2O2，最后補充各管體積至8 mL。于37 ℃下保溫1 h，在536 nm下測定吸光值，計算清除率，其計算公式為[15]：

式中：A0表示未損傷管的吸光值；A1表示損傷管的吸光值；A2表示加樣品液的吸光值。

1.2.5.5 鐵離子還原抗氧化能力（FRAP） 用蒸餾水配制pH=3.6的醋酸鈉緩沖溶液，20 mmol/L的三氯化鐵，用40 mmol/L的HCl配制10 mmol/L的2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）。將醋酸鈉緩沖液、三氯化鐵、TPTZ按10:1:1的比例混合制得工作液。取0.5 mL 70%乙醇，0.5 mL奶渣樣品液，9 mL工作液混合于37 ℃下恒溫培養(yǎng)10 min，以緩沖液為空白，測其在593 nm下的吸光度值，計算公式為[16]：

式中：C表示標曲讀數(shù)；V1表示奶渣多肽樣品液總體積，mL；V2表示所測樣品體積，mL；m表示奶渣質(zhì)量，g；10表示反應(yīng)體系總體積，mL。

1.2.5.6 過氧化氫清除能力（H2O2） 用蒸餾水配制0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.4），用緩沖溶液配制4 mmol/L過氧化氫，4.5 mmol/L苯酚紅，用苯酚紅溶液配制300 μg/mL HRPase得HRPase-苯酚紅溶液。取2 mL奶渣樣品液與800 μL過氧化氫混合，室溫培養(yǎng)20 min，以蒸餾水為對照，再加入1200 μL HRPase-苯酚紅溶液室溫培養(yǎng)10 min，用分光光度計在610 nm下測吸光度值，計算公式如下[17]：

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個樣品實驗重復(fù)3次，采用GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表示為“平均值±標準差（Mean±SD）”，SPSS 22.0進行方差分析與顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔牦牛奶渣基本營養(yǎng)成分比較

由表1、表2可知，奶渣中含有相當豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，主要成分為蛋白質(zhì)（>48 g/100 g）、脂肪（≥3 g/100 g）、灰分（>4 g/100 g）、水分（>9 g/100 g）以及鈣（>7 g/kg）、鐵（>17 g/kg）、磷（>1 g/kg）等，且隨海拔的升高，蛋白質(zhì)、鐵和維生素E的含量顯著升高（NA

表1 三種奶渣基本營養(yǎng)成分含量比較Table 1 Comparison of the contents of basic nutrients in three kinds of milk dregs

表2 三種奶渣氨基酸含量（g/100 g）比較Table 2 Comparison of amino acid content of three kinds of milk dregs (g/100 g)

2.2 不同海拔牦牛奶渣熱力學(xué)特性比較

如圖1所示，三種奶渣具有相似的熔化吸熱峰，且各個峰對應(yīng)的熔化吸熱范圍基本保持一致。NA、NB、NC三種奶渣分別對應(yīng)的溫度范圍為137.23～163.31 ℃、85.48～187.68 ℃、132.98～165.66 ℃，極值溫度分別為148.12、129.68、148.39 ℃，吸熱量分別為116.6、184.1、116.4 J/g，其中海拔2500～2800 m和4300 m以上的奶渣的極值溫度都明顯高于3500～4000 m的奶渣，推測可能是2500～2800 m和4300 m以上在水分含量以及組成成分差異所致[24?25]，對于同種物質(zhì)而言，水分含量越低，其極值溫度越低，吸熱量越高，這與前文2.1部分研究結(jié)果顯示NA、NC與NB成分差異結(jié)果一致。三種奶渣熱力學(xué)特性差異直接影響其應(yīng)用食品產(chǎn)品加工過程對產(chǎn)品品質(zhì)影響，如將這三種奶渣應(yīng)用于奶渣包子加工，因這三種奶渣熱力學(xué)差異可能會導(dǎo)致奶渣包子加熱后質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的差異。

圖1 不同海拔奶渣NA（a）、NB（b）和NC（c）熔化曲線Fig.1 Melting curves of NA (a), NB (b) and NC (c) of milk dregs at different elevations

2.3 不同海拔牦牛奶渣黏彈特性比較

圖2是不同海拔奶渣打磨成粉后的頻率掃描曲線。貯能模量G′表示奶渣在應(yīng)力能量貯存后可以恢復(fù)的彈性性質(zhì)；損耗模量G′′代表能耗不可恢復(fù)的黏性性質(zhì)；損耗模量（G′）與貯能模量（G′）的比值為損耗角正切值tanδ。由圖2a可知，隨頻率的增大，G′逐漸增大，在3個不同海拔中，奶渣G′隨海拔的上升而增加，說明隨海拔的增加，奶渣在能量貯存后可恢復(fù)的彈性性質(zhì)也在逐漸增加；圖2b表明三種不同海拔奶渣的tanδ在頻率0.01～0.1 rad/s下逐漸降低，在0.1～100 rad/s下隨頻率的增大而增大，且在3500～4000 m海拔下的奶渣tanδ顯著高于海拔4300和2800 m處的奶渣，黏性比例更大，顯示出更強的流動性。

圖2 不同海拔奶渣儲能模量（a）和tanδ（b）隨頻率變化曲線圖Fig.2 Curves of energy storage modulus (a) and tan δ (b) of milk dregs with frequency at different elevations

2.4 不同海拔奶渣揮發(fā)性成分差異比較

由圖3和表3可知，奶渣主要揮發(fā)性成分共有8類，包括醛類、酸類、烯烴類、酮類、烷烴類、酚類、醇類和苯環(huán)及其他類。奶渣中主體香型呈水果香味，奶渣NA共有24種風(fēng)味物質(zhì)，主要揮發(fā)性成分包括壬醛（42.49%）、辛醛（11.52%）、壬酸（5.09%）、檸檬烯（4.98%）等；奶渣NB共有27種風(fēng)味物質(zhì)，主要呈香物質(zhì)是壬醛（26.03%）、庚醛（9.88%）、辛醛（9.68%）、壬酸（6.93%）、D-檸檬烯（6.28%）、（E）-壬烯醛（4.97%）等；奶渣NC共有15種風(fēng)味物質(zhì)，主要呈香物質(zhì)是月桂烯（21.92%）、己醛（24.57%）、2，3-丁二醇（15.36%）、壬醛（9.1%）、苯乙醇（5.52%）、β-月桂烯（5.39%）、香茅醛（4.57%）。結(jié)果表明在三種奶渣當中，其共有揮發(fā)性成分是壬醛、苯甲醛、4,4'-(1-甲基亞乙基)雙酚、苯乙醇和鄰二氯苯，表明奶渣普遍存在玫瑰、柑橘香（參考表3，主要揮發(fā)性成分壬醛呈現(xiàn)的香氣）。而對于三種奶渣顯著差異揮發(fā)性組分，主要體現(xiàn)在壬醛（NA最高）、己醛（NC最高）、月桂烯（NC最高）、2,3-丁二醇（NC最高）、辛醛（NA最高）。且不同海拔對奶渣揮發(fā)性成分影響顯著，海拔越高，奶渣揮發(fā)性成分越簡單、純正，譬如奶渣果香更為純正。結(jié)果亦表明，牦牛奶渣揮發(fā)性組成主要是醛類（最小相對百分含量Vmin>30%），乳品中的醛類一般由油酸、亞油酸、亞麻酸、二十二碳六烯酸等不飽和脂肪酸脂肪氧化產(chǎn)生[26]，尤其是己醛則有油酸和亞油酸經(jīng)脂肪氧化產(chǎn)生，說明牦牛奶含有較高的不飽和脂肪酸，這與黃世群等報道的結(jié)果一致[26]。在牦牛奶加工成奶渣過程中，由于不飽和脂肪酸氧化作用產(chǎn)生上述醛類，構(gòu)成了牦牛奶渣主體風(fēng)味，而奶渣NC可能原料乳中含有更高比例的油酸和亞油酸，所以其在加工過程產(chǎn)生帶有青草香味的己醛單體[27]。牦牛奶渣具有花香的特征對其應(yīng)用于乳制品加工、西藏特色休閑食品非常重要，因為可以為其提供吸引人的香氣[28]。

圖3 三種不同海拔的奶渣揮發(fā)性組分含量對比圖Fig.3 Comparison of volatile components in milk dregs at three different elevations

2.5 不同海拔奶渣抗氧化活性比較

由圖4所示，西藏牦牛奶渣均有不同程度的抗氧化能力，包括DPPH自由基、超氧陰離子和羥基自由基清除能力，對鐵離子螯合抗氧化能力以及對過氧化氫清除能力，這與王高等[29]報道的結(jié)果一致。然而，不同海拔對奶渣的抗氧化活性有明顯影響，與海拔2500～2800 m處的奶渣NA相比，隨著海拔的增加，奶渣的DPPH自由基清除能力逐漸增強，NC的DPPH自由基清除能力最強（228 mmol/100 g）（圖4a）。NB的超氧陰離子清除能力顯著高于NA（P<0.05），與NC差異不顯著（P>0.05）（圖4b）。不同海拔之間羥基自由基清除能力沒有顯著差異（P>0.05）（圖4c）。與海拔3500～4000 m處的奶渣NB相比，海拔為2500～2800 m和4300 m以上的奶渣鐵離子螯合抗氧化能力（FRAP）更高（P<0.05），約為NB的2倍（圖4d）。而過氧化氫清除能力卻隨海拔的增加而降低（圖4e）。造成不同海拔的奶渣抗氧化活性的差異的原因可能主要來源于其組分的差異，奶渣中抗氧化活性成分主要是蛋白質(zhì)、多肽、不飽和脂肪酸、維生素等[30?31]，蛋白質(zhì)和多肽抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)中氨基酸的組成有關(guān)，譬如蛋白質(zhì)和多肽中組氨酸、酪氨酸、色氨酸等氨基酸具有抗氧化功能活性，而不飽和脂肪酸和維生素具有抗氧化活性，可能與其結(jié)構(gòu)中不飽和雙鍵或三鍵具有一定相關(guān)性。表2也證實NC比NA和NB在組氨酸和酪氨酸含量方面更高，一定程度反映奶渣抗氧化活性與其氨基酸組成和含量有關(guān)。

表3 三種奶渣揮發(fā)性組分相對含量Table 3 Comparison of volatile components contents from three kinds of milk dregs

圖4 不同海拔奶渣對DPPH自由基（a）、超氧陰離子（b）和羥自由基（c）清除能力，對鐵離子螯合抗氧化能力（d）以及對過氧化氫（H2O2）清除能力（e）Fig.4 Scavenging ability of milk dregs at different elevations to DPPH free radical (a), superoxide anion (b) and hydroxyl free radical(c), iron ion chelating antioxidant ability (d) and hydrogen peroxide (H2O2) scavenging ability (e)

3 結(jié)論

西藏牦牛奶渣理化、營養(yǎng)、風(fēng)味均受到海拔顯著影響（P<0.05），抗氧化功效也隨海拔的變化而變化。相較于奶渣NA和NB，高海拔奶渣NC的平均蛋白質(zhì)含量（71.00 g/100 g）、維生素A含量（3.52 μg/100 g）、維生素E含量（0.33 mg/100 g）、維生素D3含量（0.66 μg/100 g）、鐵元素含量（55.51 g/kg）、總氨基酸含量（79.32 g/100 g）和必需氨基酸含量（36.40 g/100 g）最高。相較于奶渣NA和NC，奶渣NB極值溫度（129.68 ℃）最低，而tanδ最高，說明奶渣NB流動性最佳。三種奶渣當中，其共有揮發(fā)性成分是壬醛、苯甲醛、4,4'-(1-甲基亞乙基)雙酚、苯乙醇和鄰二氯苯，表明奶渣普遍存在玫瑰、柑橘香。而對于三種奶渣顯著差異揮發(fā)性組分，主要體現(xiàn)在壬醛、己醛、月桂烯、2,3-丁二醇、辛醛。牦牛奶渣具有較好抗氧化活性，奶渣NC具有最強DPPH自由基清除能力，奶渣NA具有最強過氧化氫清除能力。本研究為全面認識西藏牦牛奶渣提供依據(jù)，對開發(fā)西藏少數(shù)民族地區(qū)特色乳制品有一定的參考價值。